Jedna bočica, dvije mete: Prijenosna dijagnoza tuberkuloze temeljena na CRISPR-u sa 100%-tnom osjetljivošću

Rad o prijenosnom testu na tuberkulozu koji se može napraviti izravno iz sputuma, bez složene opreme, objavljen je u časopisu Science Advances. Izotermna amplifikacija DNA i CRISPR očitavanje kombiniraju se u jednoj epruveti; dvije konzervativne insercije M. tuberculosis (IS6110 i IS1081) testiraju se odjednom, plus ljudski gen kao unutarnja kontrola uzorka. U malom „slijepom“ testu na kliničkim uzorcima, test je dao 100%-tnu osjetljivost (6/6) i 100%-tnu specifičnost (7/7) u usporedbi s kulturom; granica detekcije je ~69–81 CFU/ml u simuliranom sputumu. Rezultat se može vidjeti na papirnatoj test traci, a reagensi su liofilizirani (skladištenje bez „hladnog lanca“).

Pozadina

Prema WHO-u, tuberkuloza će 2023. godine ubiti oko 1,25 milijuna ljudi; tuberkuloza je ponovno postala vodeći zarazni uzrok smrti, s procijenjenih 10,8 milijuna slučajeva. Zbog toga je dostupna i brza dijagnostika ključna, posebno u okruženjima s ograničenim resursima.

• Trenutni testovi predstavljaju kompromis između točnosti, brzine i cijene. „Zlatni standard“ kulture je vrlo točan, ali spor; mikroskopija je brza, ali neosjetljiva; PCR platforme poput Xpert MTB/RIF Ultra su znatno osjetljivije (LOD ≈ 15,6 CFU/ml), ali zahtijevaju skupu opremu i patrone, što ograničava pokrivenost.
• Zašto izotermno i CRISPR. Izotermna RPA amplifikacija radi na 37–42 °C i ne zahtijeva termalne ciklere - praktično "na terenu". CRISPR očitavanje (Cas12/13) dodaje specifičnost vrste i omogućuje vizualni lateralni tok ("strip") bez složene optike. Sveukupno, ovo je put do prijenosnih i jeftinih PVR testova.
• Zašto dvije MBT mete odjednom (IS6110 + IS1081). IS6110 je višekopijski umetak kompleksa M. tuberculosis, ali neke linije imaju malo kopija i testovi samo za IS6110 mogu "promašiti". Dodavanje drugog umetka IS1081 smanjuje rizik od lažno negativnih rezultata.
• Zašto interna ljudska kontrola. Uzorci daha mogu sadržavati inhibitore i "loše" uzorke. Endogena ljudska kontrola (npr. RNase P/genomska DNA) potvrđuje da je materijal adekvatan i da reakcija nije potisnuta - inače se rezultat ne može smatrati negativnim.
• Format s jednom posudom je sam po sebi važan. Smanjuje broj koraka, smanjuje rizik od kontaminacije i olakšava rad izvan laboratorija. Takvi pristupi za tuberkulozu već su pokazali održivost; novi rad proširuje ideju na format s dva cilja s unutarnjim kontrolama, plus demonstrira liofilizaciju reagensa i čitač traka.
• Koja je vrijednost ovog članka? Autori su demonstrirali detekciju izravno iz sputuma nakon najjednostavnije pripreme uzorka, granicu detekcije od ~70–80 CFU/ml u simuliranom sputumu i 100%-tnu osjetljivost/specifičnost na malom slijepom skupu kliničkih uzoraka - dobar „tehnološki demo“ za daljnje multicentrične validacije.

Kako ovo radi

• Znanstvenici su kombinirali RPA (brzu izotermnu amplifikaciju genetskog materijala na 37 °C) s enzimima za "rezanje" Cas13a/Cas12a. Nakon što su odabrali vodeće RNA, konfigurirali su sustav da istovremeno cilja dvije MBT mete, i paralelno s ljudskom DNA (provjeravajući ima li u uzorku uopće materijala i je li reakcija "zaustavljena").
• Sav kemijski postupak ide u jednu epruvetu; nakon inkubacije, rezultat se očitava ili fluorimetrom ili na lateralnoj protočnoj traci - u biti kao ekspresni test.
• Obrada sputuma pojednostavljena je na zagrijavanje i kratko centrifugiranje - bez ekstraktora nukleinskih kiselina. Za najograničenije uvjete, autori čak raspravljaju o ručnim alternativama centrifugi.

Što su testovi pokazali

• Granica detekcije: 69,0 CFU/ml (soj H37Rv) i 80,5 CFU/ml (BCG) u "spike" sputumu. Nije otkrivena unakrsna reaktivnost s drugim bakterijama/gljivicama.
• Kliničko okruženje (zaslijepljeni uzorci): na 13 uzoraka iz stvarne prakse - 100% osjetljivost (6/6) i 100% specifičnost (7/7) u odnosu na zasijavanje. Za usporedbu, na istom kompletu GeneXpert Ultra pokazao je 100%/86%.
• Tehničke nijanse: od dvije opcije očitavanja, Cas13a je radio bolje (za format "one-pot", osjetljiviji je od Cas12a). Osim toga, paralelno testiranje dvaju Mtb ciljeva smanjuje rizik od lažnih rezultata.

Zašto je ovo potrebno?

Današnji testovi su kompromis između točnosti, brzine i dostupnosti: kultura je vrlo točna, ali spora; brisevi su brzi, ali netočni; PCR sustavi poput GeneXperta su točni i brzi, ali zahtijevaju skupe instrumente i patrone. Novi CRISPR pristup ima za cilj zatvoriti taj jaz: terenska dijagnostika koja radi na 37°C, s očitanjima papirnatih traka i mogućnošću pohranjivanja reagensa bez hlađenja.

Ograničenja i što dalje

Ovo je rana demonstracija na malom kliničkom skupu - potrebni su veliki, multicentrični testovi (uključujući HIV koinfekciju, kod djece, s paucibacilnim oblicima i različitim MBT linijama). Autori zasebno napominju da će se u samoj "terenskoj" verziji stolna centrifuga morati zamijeniti potpuno ručnim rješenjem. Ali sama arhitektura - "dva cilja + unutarnja kontrola" u jednoj epruveti - već je dokazala svoju operabilnost i pruža jasan put do usavršavanja za masovnu upotrebu.

Izvor: Alexandra G. Bell i dr. Pojednostavljeni test temeljen na CRISPR-u za izravno otkrivanje tuberkuloze iz sputuma, Science Advances, online 6. kolovoza 2025. (sv. 11, broj 32). DOI: 10.1126/sciadv.adx206