Nevirusna genska terapija nudi nadu za kroničnu bol u donjem dijelu leđa

U nedavnoj studiji objavljenoj u časopisu Biomaterials, istraživači su razvili novu nevirusnu gensku terapiju za liječenje diskogene boli u leđima (DBP) isporukom transkripcijskog faktora Forkhead Kutija F1 (FOXF1) pomoću projektiranih izvanstaničnih vezikula (eEV) u degenerativne intervertebralne diskove (IVD) in vivo.

Kronična bol u donjem dijelu leđa (LBP) rastući je globalni problem zbog starenja stanovništva i pogoršanja problema s opioidima. Trenutačni tretmani uključuju kratkotrajno olakšanje ili skupe operacije, naglašavajući potrebu za neovisnim i manje invazivnim terapijama.

Trenutne biološke terapije, uključujući primjenu faktora rasta, staničnu terapiju i virusne genske terapije, mogu smanjiti degeneraciju u životinjskim i ljudskim modelima. Međutim, zabrinutost kao što su kratkoročni učinci, loša dugoročna učinkovitost i nepotrebna imunogenost i tumorigenost mogu spriječiti izravnu primjenu ovih metoda.

U ovoj su studiji istraživači uspostavili nevirusnu gensku terapiju za degeneraciju intervertebralnog diska (IVD) koristeći FOXF1-eEV.

Istraživači su transficirali primarne mišje embrionalne fibroblaste (PMEF) s plazmidom koji je sadržavao FOXF1 ili pCMV6 kao kontrolu i karakterizirali eEV uzorke pomoću testa praćenja nanočestica (NTA).

Procijenili su učinkovito učitavanje molekularnog tereta u eEVs pomoću kvantitativne reverzne transkripcije-lančane reakcije polimeraze (qRT-PCR) i konvencionalne PCR. Western blot analiza identificirala je FOXF1 i specifične EV proteine u eEV formacijama. Tim je koristio plazmide koji poboljšavaju uzvodne i nizvodne polilinker regije kako bi odredili prisutnost FOXF1 plazmidne DNA u donorskim stanicama i generirali eEV.

Istraživali su mRNA pune duljine proizvedenu iz plazmidne DNA u eEV-ima i donorskim stanicama.

Istraživači su stvorili izvanstanične vezikule s faktorima transkripcije kako bi obnovili funkciju tkiva i modificirali reakcije na bol u životinjskom modelu DBP-a.

Identificirali su EV za prijenos i distribuciju FOXF1 do oštećenih intervertebralnih diskova u mišjem modelu diskogene boli u leđima kako bi odredili inhibiciju FOXF1 eEV degeneracije intervertebralnog diska.

Tim je kombinirao biomehaničko testiranje mišjih intervertebralnih diskova sa slikanjem, promjenama izvanstaničnog matriksa (ECM) i reakcijama na bol procijenjenim nakon 12 tjedana kako bi se potvrdile promjene u strukturi i funkciji, kao i bol izazvana terapijskom intervencijom.

Procjene boli prije operacije i nakon tretmana uključivale su mikro-kompjutoriziranu tomografiju (mikro-CT), magnetsku rezonanciju (MRI), mehaničke testove, bojenje Alcian blue (AB) i picrosirius crveno (PSR), test dimetilmetilen plavim i imunohistokemiju (IHC) ) ).

Studija je uključivala kiruršku tehniku u kojoj su istraživači supkutano ubrizgali Buprenorphine ER u miševe kako bi kontrolirali postoperativnu bol.

Tim je proveo procjenu ponašanja prije operacije i svaka dva tjedna od četiri do dvanaest tjedana nakon operacije, koristeći različite tehnike kao što su test otvorenog polja, hladna ploča, ovjes na repu i ovjes na žici.

Test na otvorenom polju procijenio je spontanu aktivnost miševa; testovi hladne ploče mjerili su toplinsku hiperalgeziju; Testovi ovjesa repa mjerili su aksijalnu bol; i ispitivanja žičanog ovjesa izmjerene čvrstoće.

Dvanaest tjedana nakon operacije, tim je secirao lumbalne kralježnice životinja, koristeći praćenje bedrenog živca i arterije kako bi identificirao intervertebralne diskove između L4 i L5, L5 i L6, te L6 i S1 IVD. Koristili su L5/L6 IVD za procjenu histologije i određivanje sadržaja glikozaminoglikana (GAG).

FOXF1 eEV značajno su smanjili reakcije na bol dok su vraćali IVD strukturu i funkciju, uključujući poboljšanja u visini diska, hidrataciji tkiva, sadržaju proteoglikana i mehaničkim svojstvima.

Studija se usredotočila na otpuštanje eEV-ova napunjenih FOXF1 iz primarnih fibroblasta transficiranih transkripcijskim faktorom FOXF1. Kvantitativni RT PCR pokazao je značajno povećanje razina transkripta FOXF1 mRNA i razina transkribirane FOXF1 mRNA pune duljine u usporedbi sa stanicama transficiranim s pCMV6.

Terapija FOXF1 eEV može smanjiti reakcije na bol u modelu miša s lumbalnom punkcijom diska do 12 tjedana. Ženke miševa pokazale su dulja vremena stjecanja u skupini liječenoj FOXF1 nego u skupini s lezijom, što je trajalo najmanje 12 tjedana nakon tretmana.

Terapija FOXF1 eEV poboljšala je hidraciju i visinu IVD tkiva kod ozlijeđenih i degenerativnih životinja in vivo uz održavanje razine hidracije i T2-ponderiranog intenziteta IVD slike.

Međutim, tim je primijetio smanjenje visine diska kod ranjenih životinja i životinja liječenih s pCMV6 eEV. Miševi tretirani s FOXF1 eEV nisu imali smanjenje visine diska 12 tjedana nakon tretmana. Spol nije utjecao na funkcionalne rezultate.

FOXF1 eEV obnovili su mehaničku funkciju oštećenih i degeneriranih IVD-ova in vivo. Pod aksijalnim stresom, IVD-ovi tretirani FOXF1 eEV-om pokazali su veću normaliziranu NZ krutost u usporedbi s oštećenim IVD-ovima.

U uvjetima puzanja, oštećeni IVD-ovi pokazali su povećane normalizirane pomake puzanja, što ukazuje na smanjenje normalizirane elastične krutosti puzanja.

Rezultati pokazuju da smanjenje sadržaja GAG-a u oštećenim IVD-ovima povećava mehaničku fleksibilnost, ali eEV terapija sprječava gubitak glikozaminoglikana i naknadne promjene mehaničke funkcije.

FOXF1 eEV uzrokovao je strukturne i funkcionalne promjene u IVD-u povećanjem razina proteoglikana i GAG-ova.

Rezultati studije pokazali su da eEV-ovi puni razvojnih transkripcijskih faktora mogu liječiti bolne bolesti zglobova kao što je DBP isporukom tih transkripcijskih faktora degenerativnim i bolnim IVD zglobovima.

Ova strategija može pomoći u smanjenju strukturnih i funkcionalnih abnormalnosti uzrokovanih bolešću, kao i regulirati reakcije na bol specifične za spol.

Istraživači su također preporučili korištenje faktora razvojne transkripcije kao što je FOXF1 za pretvaranje degenerativnih NP stanica u proanaboličko stanje in vivo. Potrebna su daljnja istraživanja kako bi se utvrdila njegova terapeutska učinkovitost.