Nevirusna genska terapija nudi nadu za kroničnu bol u donjem dijelu leđa

U nedavnoj studiji objavljenoj u časopisu Biomaterials, istraživači su razvili novu nevirusnu gensku terapiju za liječenje diskogene boli u leđima (DBP) isporukom transkripcijskog faktora Forkhead Box F1 (FOXF1) korištenjem konstruiranih izvanstaničnih vezikula (eEV) u degenerativne intervertebralne diskove (IVD) in vivo.

Kronična bol u donjem dijelu leđa (LBP) rastući je globalni problem zbog starenja stanovništva i pogoršanja problema s opioidima. Trenutni tretmani uključuju kratkotrajno olakšanje ili skupe operacije, što naglašava potrebu za terapijama koje ne izazivaju ovisnost i su manje invazivne.

Trenutni biološki pristupi, uključujući primjenu faktora rasta, staničnu terapiju i virusnu gensku terapiju, mogu smanjiti degeneraciju u životinjskim i ljudskim modelima. Međutim, problemi poput kratkoročnih učinaka, slabe dugoročne učinkovitosti te nepotrebne imunogenosti i onkogenosti mogu ometati izravnu primjenu ovih pristupa.

U ovoj studiji, istraživači su uspostavili nevirusnu gensku terapiju za degeneraciju intervertebralnog diska (IVD) koristeći FOXF1-eEV.

Istraživači su transficirali primarne mišje embrionalne fibroblaste (PMEF) plazmidima koji sadrže FOXF1 ili pCMV6 kao kontrolu i karakterizirali uzorke eEV-a pomoću testa praćenja nanočestica (NTA).

Procijenili su učinkovito utovarivanje molekularnog tereta u eEV-e koristeći kvantitativnu lančanu reakciju reverzne transkripcije-polimeraze (qRT-PCR) i konvencionalnu PCR. Western blot analiza identificirala je FOXF1 i EV-specifične proteine u eEV formacijama. Tim je koristio plazmide koji pojačavaju gornje i donje polilinkerske regije kako bi utvrdio prisutnost FOXF1 plazmidne DNA u donorskim stanicama i generirao eEV-e.

Ispitali su mRNA pune duljine proizvedenu iz plazmidne DNA u eEV-ima i donorskim stanicama.

Istraživači su stvorili izvanstanične vezikule s transkripcijskim faktorima kako bi obnovili funkciju tkiva i promijenili reakcije na bol u životinjskom modelu DBP-a.

Identificirali su EV-ove za transport i distribuciju FOXF1 u oštećene intervertebralne diskove u mišjem modelu diskogene boli u leđima kako bi utvrdili inhibiciju degeneracije intervertebralnog diska od strane FOXF1 eEV-a.

Tim je kombinirao biomehaničko testiranje mišjih intervertebralnih diskova sa snimanjem, promjenama izvanstanične matrice (ECM) i odgovorima na bol procijenjenim nakon 12 tjedana kako bi potvrdili promjene u strukturi i funkciji, kao i bol, izazvane terapijskom intervencijom.

Preoperativne i postoperativne procjene boli uključivale su mikro-kompjutoriziranu tomografiju (mikro-CT), magnetsku rezonancu (MRI), mehaničko testiranje, bojenje Alcian plavilom (AB) i pikrosirius crvenim (PSR), test dimetilmetilen plavilom i imunohistokemiju (IHC).

Studija je uključivala kiruršku tehniku u kojoj su istraživači miševima subkutano davali buprenorfin ER kako bi kontrolirali postoperativnu bol.

Tim je provodio procjene ponašanja prije operacije i svaka dva tjedna od četiri do 12 tjedana nakon operacije, koristeći razne metode, uključujući test otvorenog polja, hladnu ploču, repnu suspenziju i žicu za suspenziju.

Test otvorenog polja procijenio je spontanu aktivnost miševa; testovi hladne ploče mjerili su toplinsku hiperalgeziju; testovi repne suspenzije mjerili su aksijalnu bol; a testovi žičane suspenzije mjerili su snagu.

Dvanaest tjedana nakon operacije, tim je secirao lumbalne kralježnice životinja koristeći trasiranje femoralnih živaca i arterija kako bi identificirali intervertebralne diskove između L4 i L5, L5 i L6 te L6 i S1 IVD. Koristili su L5/L6 IVD za procjenu histologije i određivanje sadržaja glikozaminoglikana (GAG).

FOXF1 eEV-ovi značajno su smanjili reakcije na bol, a istovremeno su obnovili strukturu i funkciju IVD-a, uključujući poboljšanu visinu diska, hidrataciju tkiva, sadržaj proteoglikana i mehanička svojstva.

Studija se usredotočila na oslobađanje eEV-ova napunjenih FOXF1 iz primarnih fibroblasta transficiranih transkripcijskim faktorom FOXF1. Kvantitativna RT PCR pokazala je značajan porast razina transkripcije FOXF1 mRNA i razina transkribirane FOXF1 mRNA pune duljine u usporedbi sa stanicama transficiranim pCMV6.

Terapija FOXF1 eEV-om može smanjiti bolne reakcije u modelu punkcije lumbalnog diska kod miševa do 12 tjedana. Ženke miševa pokazale su dulje vrijeme napadaja u skupini tretiranoj FOXF1 nego u ozlijeđenoj skupini, što je trajalo najmanje 12 tjedana nakon tretmana.

Terapija FOXF1 eEV poboljšala je hidrataciju i visinu IVD tkiva kod ozlijeđenih i degenerativnih životinja in vivo, uz održavanje razine hidratacije i intenziteta T2-ponderirane slike IVD diska.

Međutim, tim je uočio smanjenje visine diska kod ozlijeđenih životinja i životinja tretiranih s pCMV6 eEV. Miševi tretirani s FOXF1 eEV nisu imali smanjenje visine diska 12 tjedana nakon tretmana. Spol nije utjecao na funkcionalne ishode.

FOXF1 eEV-ovi su in vivo obnovili mehaničku funkciju oštećenih i degeneriranih IVD-ova. Pod aksijalnim stresom, IVD-ovi tretirani FOXF1 eEV-ovima pokazali su veću normaliziranu NZ krutost u usporedbi s oštećenim IVD-ima.

U uvjetima puzanja, oštećeni IVD-i pokazali su povećane normalizirane pomake puzanja, što ukazuje na smanjenje normalizirane elastične krutosti puzanja.

Rezultati pokazuju da smanjenje sadržaja GAG-a u oštećenim IVD-ima povećava mehaničku fleksibilnost, ali eEV terapija sprječava gubitak glikozaminoglikana i posljedične promjene u mehaničkoj funkciji.

FOXF1 eEV-i inducirali su strukturne i funkcionalne promjene u IVD-u povećanjem razine proteoglikana i GAG-a.

Rezultati studije pokazali su da eEV-i napunjeni razvojnim transkripcijskim faktorima mogu liječiti bolne bolesti zglobova poput DBP-a isporukom tih transkripcijskih faktora u degenerativne i bolne zglobove putem IVD-a.

Ova strategija može pomoći u smanjenju strukturnih i funkcionalnih abnormalnosti uzrokovanih bolešću i regulirati bolne reakcije na način specifičan za spol.

Istraživači su također preporučili korištenje razvojnih transkripcijskih faktora poput FOXF1 za prelazak degenerativnih NP stanica u proanaboličko stanje in vivo. Potrebna su daljnja istraživanja kako bi se utvrdila njegova terapijska učinkovitost.