Neuralne matične stanice

Eksperimentalni dokazi o mogućnosti regeneracije stanica središnjeg živčanog sustava dobiveni su mnogo ranije od otkrića embrionalnih matičnih stanica u studijama koje su pokazale prisutnost stanica u neokorteksu, hipokampusu i olfaktornim bulbusima mozga odraslih štakora koje hvataju 3H-timidin, tj. sposobne su za sintezu i diobu proteina. Još 60-ih godina prošlog stoljeća pretpostavljalo se da su te stanice prekursori neurona i izravno su uključene u procese učenja i pamćenja. Nešto kasnije otkrivena je prisutnost sinapsi na neuronima nastalim de novo te su se pojavili prvi radovi o korištenju embrionalnih matičnih stanica u svrhu induciranja neurogeneze in vitro. Krajem 20. stoljeća eksperimenti s usmjerenom diferencijacijom embrionalnih matičnih stanica u neuronske progenitorske stanice, dopaminergičke i serotonergične neurone doveli su do revizije klasičnih ideja o sposobnosti regeneracije živčanih stanica sisavaca. Rezultati brojnih studija uvjerljivo su dokazali i stvarnost restrukturiranja neuronskih mreža i prisutnost neurogeneze tijekom cijelog postnatalnog života sisavčevog organizma.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ]

Izvori neuralnih matičnih stanica

Ljudske živčane matične stanice izoliraju se tijekom operacija na subventrikularnoj regiji lateralnih ventrikula i dentatnom girusu hipokampusa, čije stanice u kulturi tvore neurosfere (neuralne sfere), a nakon disperzije i preformiranja potonjih - sve glavne tipove stanica središnjeg živčanog sustava ili, u posebnom mediju, nove mikrosfere. U suspenzijskim kulturama disociranog tkiva izoliranog iz periventrikularnih regija embrionalnog mozga također nastaju neurosfere.

Markeri nezrelih moždanih stanica uključuju nestin, beta-tubulin III (marker neuronske loze), vimentin, GFAP i NCAM, koji se identificiraju imunocitokemijski pomoću monoklonskih antitijela. Nestin (intermedijarni neurofilamentni protein tip IV) eksprimiraju multipotentne neuroektodermalne stanice. Ovaj protein se koristi za identifikaciju i izolaciju multipotentnih neuroepitelnih progenitorskih stanica iz središnjeg živčanog sustava pomoću monoklonskih antitijela Rat-401, koja mogu detektirati do 95% stanica neuralne cijevi u štakorskim embrijima jedanaestog dana gestacije. Nestin se ne eksprimira na diferenciranim potomcima neuralnih matičnih stanica, ali je prisutan u ranim neuralnim progenitorskim stanicama, postmitotskim neuronima i ranim neuroblastima. Ovaj marker se koristi za identifikaciju neuroepitelnih progenitorskih stanica i za dokazivanje postojanja matičnih stanica u središnjem živčanom sustavu. Vimentin (intermedijarni neurofilamentni protein tip III) eksprimiraju neuralne i glialne progenitorske stanice, kao i neuroni, fibroblasti i stanice glatkih mišića. Stoga, oba imunocitokemijska markera nemaju specifičnost potrebnu za zasebnu identifikaciju živčanih matičnih i progenitorskih stanica. Beta-tubulin III uspostavlja neuronski smjer diferencijacije matičnih stanica, dok se astrociti tipa I identificiraju ekspresijom GFAP-a, a oligodendrociti specifično eksprimiraju galaktocerebrozid (Ga!C).

FGF2 i EGF služe kao mitogeni za neuralne progenitorske stanice, podržavajući proliferaciju nediferenciranih progenitorskih stanica u kulturi stvaranjem neurosfera. Brzina diobe neuralnih matičnih stanica značajno se povećava pod utjecajem FGF2, kao i korištenjem kombinacije FGF2 + EGF. Proliferativni učinci FGF2 posredovani su FGF2-R1 receptorima. Heparin povećava afinitet vezanja FGF2 receptora i dramatično pojačava njegov mitogeni učinak na neuroepitelne stanice. U ranim fazama embriogeneze, FGF2 receptori se eksprimiraju u telencefalonu štakora, dok je u kasnijim fazama njihova lokalizacija ograničena na ventrikularnu zonu. Vrhunac ekspresije FGF2-R1 postmitotičkim stanicama opaža se nakon završetka ranog razdoblja neurogeneze. Početno razdoblje razvoja telencefalona karakterizira niska razina ekspresije EGF receptora, uglavnom u stanicama ventralne regije. U kasnijim fazama embriogeneze, ekspresija EGF-R raste u dorzalnom smjeru. U mozgu glodavaca, EGF ima visoki afinitet za receptor transformirajućeg faktora rasta beta (TGF-beta-R), na koji se preferencijalno veže. Neizravni dokazi za funkcionalnu ulogu EGF-R pružaju se podacima o kortikalnoj disgenezi prednjeg mozga koja se javlja u kasnom razdoblju embriogeneze i postnatalne ontogeneze, smanjenoj funkciji prednjeg mozga, smrti kortikalnih stanica i ektopiji hipokampusa kod miševa s knockoutom gena EGF receptora. Osim toga, prisutnost TGF-a u hranjivoj podlozi apsolutno je neophodna za stvaranje neurosfera. Nakon uklanjanja faktora rasta iz uvjetovane podloge, stanice prestaju s dijeljenjem i podliježu spontanoj diferencijaciji stvaranjem neurona, astrocita i oligodendroblasta.

Uzimajući to u obzir, reagregacija disociranih matičnih stanica i uzgoj neurosfera provode se u hranjivim medijima koji sadrže EGF i bazni FGF ili FGF2, ali bez dodavanja seruma. Pokazalo se da EGF inducira proliferaciju matičnih stanica subependimalne zone lateralnih ventrikula, a bazni FGF potiče proliferaciju matičnih stanica striatuma, hipokampusa, neokorteksa i vidnog živca zrelog mozga. Kombinacija EGF-a i baznog FGF-a apsolutno je neophodna za aktivnu proliferaciju matičnih stanica izoliranih iz ependima treće i četvrte ventrikule prednjeg mozga, kao i iz spinalnog kanala torakalne i lumbalne leđne moždine.

Nakon disocijacije, suspenzija živčanih matičnih stanica uzgaja se u plastičnim zdjelicama ili višejažnim pločama bez adhezivne podloge kako bi se povećala veličina novostvorenih neurosfera, što obično traje oko 3 tjedna. Metoda višestruke disperzije i reprodukcije neurosfera omogućuje dobivanje dovoljnog broja linearnih klonova multipotentnih matičnih stanica za intracerebralnu transplantaciju. Ovaj princip je također osnova za stvaranje banke matičnih stanica izoliranih iz ljudskog embrionalnog mozga. Njihovo dugoročno (tijekom nekoliko godina) kloniranje omogućuje dobivanje stabilnih linija živčanih matičnih stanica, iz kojih se tijekom inducirane diferencijacije formiraju kateholaminergički neuroni.

Ako se neurosfere ne dispergiraju i ne rastu na adhezivnim podlogama u medijima kojima nedostaju faktori rasta, proliferirajuće matične stanice počinju se spontano diferencirati i formiraju neuronske i glialne prekursorske stanice koje eksprimiraju markere svih vrsta živčanih stanica: MAP2, Tau-1, NSE, NeuN, beta-tubulin III (neuroni), GFAP (astrociti) i CalC, 04 (oligodendrociti). Za razliku od stanica miša i štakora, neuroni čine više od 40% svih diferenciranih stanica u kulturama ljudskih živčanih matičnih stanica (od 1 do 5% kod glodavaca), ali se formira znatno manje oligodendrocita, što je vrlo važno s gledišta stanične terapije demijelinizirajućih bolesti. Problem se rješava dodavanjem B104 medija za kulturu, koji stimulira stvaranje stanica koje proizvode mijelin.

Prilikom uzgoja neuronskih progenitorskih stanica iz mozga ljudskih embrija u mediju koji sadrži EGF, bazični FGF i LIF, broj prekursorskih stanica neuronske loze povećava se 10 milijuna puta. Stanice ekspandirane in vitro zadržavaju sposobnost migracije i diferencijacije u neuronske i glialne elemente nakon transplantacije u mozak zrelih štakora. Međutim, in vivo je broj dioba multipotentnih prekursorskih stanica ograničen. Više puta je napomenuto da je Hayflickova granica za „odrasle“ neuronske matične stanice (oko 50 mitoza) još uvijek nedostižna čak ni u eksperimentu - stanice u obliku neurosfera zadržavaju svoja svojstva samo 7 mjeseci i tek nakon 8 pasaža. Smatra se da je to zbog osobitosti njihovih metoda disperzije tijekom pasaža (tripsinizacija ili mehaničko djelovanje), što oštro smanjuje proliferativnu aktivnost stanica zbog poremećaja međustaničnih kontakata. Doista, ako se umjesto disperzije koristi metoda dijeljenja neurosfera na 4 dijela, održivost stanica tijekom pasaža značajno se povećava. Ova metoda omogućuje uzgoj ljudskih neuronskih matičnih stanica tijekom 300 dana. Međutim, nakon tog razdoblja stanice gube mitotičku aktivnost i podliježu degeneraciji ili ulaze u fazu spontane diferencijacije s formiranjem neurona i astrocita. Na temelju toga autor smatra da je 30 mitoza maksimalan broj dioba za kultivirane živčane matične stanice.

Kada se ljudske živčane matične stanice uzgajaju in vitro, pretežno se formiraju GABAergički neuroni. Bez posebnih uvjeta, živčane progenitorske stanice daju dopaminergičkim neuronima (neophodnim za staničnu terapiju Parkinsonove bolesti) samo u prvim pasažima, nakon čega se svi neuroni u kulturi sastoje isključivo od GABAergičkih stanica. Kod glodavaca, IL-1 i IL-11, kao i fragmenti membrana živčanih stanica, LIF i GDNF, uzrokuju indukciju dopaminergičnih neurona in vitro. Međutim, ovaj metodološki pristup pokazao se neuspješnim kod ljudi. Ipak, kada se GABAergički neuroni transplantiraju intracerebralno in vivo, pod utjecajem čimbenika mikrookoliša, nastaju živčane stanice s različitim fenotipovima medijatora.

Potraga za kombinacijama neurotrofičnih faktora pokazala je da FGF2 i IL-1 induciraju stvaranje dopaminergičnih neuroblasta, koji, međutim, nisu sposobni proizvoditi dopaminske neurone. Diferencijacija hipokampalnih matičnih stanica u ekscitacijske glutamatergičke i inhibitorne GABA-ergičke neurone događa se pod utjecajem neurotrofina, a EGF i IGF1 induciraju stvaranje glutamatergičkih i GABA-ergičkih neurona iz neuronskih progenitorskih stanica ljudskih embrija. Sekvencijalnim dodavanjem retinoične kiseline i neurotrofina 3 (NT3) u kulturu značajno se povećava diferencijacija zrelih hipokampalnih matičnih stanica mozga u neurone različite prirode medijatora, dok kombinacija neurotrofičnog faktora izvedenog iz mozga (BNDF), NT3 i GDNF može proizvesti piramidalne neurone u hipokampalnim i neokortikalnim kulturama.

Dakle, rezultati brojnih studija pokazuju da su, prvo, matične stanice iz različitih moždanih struktura pod utjecajem lokalnih specifičnih tkivnih čimbenika sposobne diferencirati se in vivo u neuronske fenotipove svojstvene tim strukturama. Drugo, ciljana inducirana diferencijacija neuronskih matičnih stanica in vitro korištenjem kloniranja progenitorskih stanica omogućuje dobivanje živčanih i glialnih stanica sa specifičnim fenotipskim karakteristikama za intracerebralnu transplantaciju u različitim oblicima moždane patologije.

Nema sumnje da se pluripotentne matične stanice izolirane iz embrija ili odraslog središnjeg živčanog sustava (CNS) mogu smatrati izvorom novih neurona i koristiti u klinici za liječenje neurološke patologije. Međutim, glavna prepreka razvoju praktične stanične neurotransplantacije je činjenica da se većina živčanih matičnih stanica ne diferencira u neurone nakon implantacije u ne-neurogene zone zrelog CNS-a. Kako bi se zaobišla ova prepreka, predlaže se vrlo originalna inovativna metoda koja omogućuje in vitro dobivanje čiste populacije neurona iz ljudskih fetalnih živčanih matičnih stanica nakon transplantacije u CNS zrelog štakora. Autori dokazuju da diferencijacija stanica implantiranih ovom metodom završava stvaranjem neurona kolinergičkog fenotipa, što je posljedica utjecaja čimbenika okolnog mikrookruženja. Predložena tehnologija je zanimljiva s gledišta razvoja novih vrsta terapije temeljene na matičnim stanicama i zamjene neurona oštećenih zbog ozljede ili neurodegenerativne bolesti, budući da kolinergički neuroni igraju vodeću ulogu u razvoju motoričkih, memorijskih i funkcija učenja. Konkretno, kolinergički neuroni izolirani iz ljudskih matičnih stanica mogu se koristiti za zamjenu motoričkih neurona izgubljenih u amiotrofičnoj lateralnoj sklerozi ili ozljedama leđne moždine. Trenutno nema informacija o metodama za proizvodnju značajnog broja kolinergičkih neurona iz populacije mitogenom preformiranih matičnih stanica. Autori predlažu prilično jednostavnu, ali učinkovitu metodu za stimuliranje mitogenom preformiranih primarnih ljudskih embrionalnih živčanih matičnih stanica da se razviju u gotovo čiste neurone nakon implantacije u neneurogene i neurogene zone središnjeg živčanog sustava zrelog štakora. Najvažniji rezultat njihovog rada je pretvorba dovoljno velikog broja transplantiranih stanica u kolinergičke neurone kada se implantiraju u srednju membranu i leđnu moždinu.

Osim toga, za preformiranje neuronskih matičnih stanica iz 8-tjedne moždane kore ljudskog embrija u kolinergičke neurone in vitro, predlaže se korištenje različitih kombinacija sljedećih trofičkih čimbenika i kemijskih elemenata: rekombinantni bazni FGF, EGF, LIF, mišji amino-terminalni zvučni peptid (Shh-N), trans-retinoična kiselina, NGF, BDNF, NT3, NT4, prirodni laminin i mišji heparin. Izvorna linija ljudskih neuronskih matičnih stanica (K048) održavana je in vitro dvije godine i izdržala je 85 pasaža bez promjena u proliferativnim i diferencijacijskim svojstvima, uz održavanje normalnog diploidnog kariotipa. Nedisperzirane neurosfere pasaža 19-55 (tjedni 38-52) nasađene su na poli-d-lizin i laminin, a zatim tretirane gore spomenutim čimbenicima u različitim koncentracijama, kombinacijama i sekvencama. Kombinacija bazne FGF, heparina i laminina (skraćeno FHL) dala je jedinstven učinak. Nakon jednog dana uzgoja embrionalnih živčanih matičnih stanica u FHL mediju sa ili bez Shh-N (kombinacija Shh-N + FHL u kratici SFHL), uočena je brza proliferacija velikih planarnih stanica. Svi ostali jednodnevni protokoli (poput osnovnog FGF + laminina), naprotiv, doveli su do ograničenog radijalnog širenja vretenastih stanica, a te stanice nisu napustile jezgru neurosfera. Nakon 6 dana aktivacije i sljedećih 10 dana diferencijacije u mediju koji sadrži B27, velike multipolarne stanice slične neuronima otkrivene su na rubu FHL-aktiviranih sfera. U drugim protokolnim skupinama, većina stanica sličnih neuronima ostala je mala i bipolarna ili unipolarna. Imunocitokemijska analiza pokazala je da su male (< 20 μm) bipolarne ili unipolarne stanice bile ili GABAergične ili glutamatergične, dok je većina velikih multipolarnih stanica lokaliziranih na rubu FHL-aktiviranih neurosfera bila kolinergična, eksprimirajući markere karakteristične za kolinergičke neurone (Islet-1 i ChAT). Neki od ovih neurona istovremeno su eksprimirali sinapsin 1. Kao rezultat pet serija neovisnih eksperimenata, autori su otkrili da se ukupna populacija stanica u jednoslojnim zonama diferencirala u TuJ1+ neurone za 45,5%, dok su kolinergički (ChAT^) neuroni činili samo 27,8% stanica iste populacije. Nakon 10 dana dodatne diferencijacije in vitro, osim kolinergičkih neurona, značajan broj malih neurona pronađen je u FHL-aktiviranim neurosferama - glutamatergički (6,3%), GABA-ergični (11,3%), kao i astrociti (35,2%) i nestin-pozitivne stanice (18,9%). Pri korištenju drugih kombinacija faktora rasta, kolinergički neuroni su bili odsutni, a marginalne stanice neurosfera formirale su ili astrocite ili male glutamatergičke i GABA-ergičke neurone. Praćenje rezervnih i aktivnih potencijala korištenjem tehnike patch clamp-a za cijele stanice pokazalo je da je nakon sedam dana aktivacije FHL-a većina velikih polipolarnih stanica imala potencijal mirovanja od -29,0 ± 2,0 mV u odsutnosti akcijskog potencijala. Nakon 2 tjedna, potencijal mirovanja povećao se na -63.6±3,0 mV, a akcijski potencijali su uočeni u trenutku indukcije depolarizirajućih struja i blokirani su pomoću 1 M tetrodotoksina, što ukazuje na funkcionalnu aktivnost kolinergičkih nezrelih neurona.

Autori su nadalje utvrdili da aktivacija FHL-a ili SFHL-a in vitro per se ne rezultira stvaranjem zrelih neurona te su pokušali utvrditi jesu li matične stanice prethodno formirane FHL-om ili SFHL-om sposobne za diferencijaciju u kolinergičke neurone kada se transplantiraju u CNS zrelih štakora. U tu svrhu, aktivirane stanice su injektirane u neurogenu zonu (hipokampus) i u nekoliko neneurogenih zona, uključujući prefrontalni korteks, srednju membranu i leđnu moždinu odraslih štakora. Implantirane stanice su praćene pomoću CAO-^^p vektora. Poznato je da OCP označava i staničnu ultrastrukturu i stanične procese (molekularna razina) bez propuštanja i može se izravno vizualizirati. Osim toga, OCP-om označene živčane matične stanice održavaju profil neuronske i glialne diferencijacije identičan onome netransformiranih matičnih stanica embrionalnog mozga.

Jedan do dva tjedna nakon implantacije 5 x 10⁴ ^aktiviranih i obilježenih živčanih matičnih stanica, one su pronađene u leđnoj moždini ili mozgu štakora, s OCD+ stanicama smještenim uglavnom u blizini mjesta injekcije. Procesi migracije i integracije uočeni su već mjesec dana nakon transplantacije. Granice migracije varirale su ovisno o mjestu injekcije: kada su ubrizgane u prefrontalni korteks, OCD+ stanice su se nalazile 0,4-2 mm od mjesta injekcije, dok su u slučaju implantacije u srednju membranu, hipokampus ili leđnu moždinu, stanice migrirale na mnogo veće udaljenosti - do 1-2 cm. Transplantirane stanice bile su lokalizirane u visoko organiziranim strukturama središnjeg živčanog sustava, uključujući frontalni korteks, srednju membranu, hipokampus i leđnu moždinu. OCD-obilježeni neuronski elementi bili su vidljivi već prvi tjedan nakon transplantacije, a njihov broj značajno se povećao mjesec dana nakon operacije. Stereološka analiza pokazala je veću stopu preživljavanja implantiranih stanica u različitim strukturama mozga, u usporedbi s leđnom moždinom.

Poznato je da je u većini tkiva odraslog sisavčevog organizma očuvana populacija regionalnih matičnih stanica čija je transformacija u zrele stanice regulirana specifičnim tkivnim čimbenicima. Proliferacija matičnih stanica, diferencijacija progenitorskih stanica i stvaranje neuronskih fenotipova specifičnih za određenu moždanu strukturu in vivo izraženi su u mnogo većoj mjeri u embrionalnom mozgu, što je određeno prisutnošću visokih koncentracija morfogenetskih čimbenika lokalnog mikrookruženja - neurotrofina BDNF, NGF, NT3, NT4/5 i čimbenika rasta FGF2, TGF-a, IGF1, GNDF, PDGF.

Gdje se nalaze neuralne matične stanice?

Utvrđeno je da neuralne matične stanice eksprimiraju glijalni kiseli fibrilarni protein, koji se među zrelim stanicama neuralne loze zadržava samo na astrocitima. Stoga, astrocitne stanice mogu biti rezerva matičnih stanica u zrelom središnjem živčanom sustavu (CNS). Doista, neuroni koji potječu od GFAP-pozitivnih prekursora identificirani su u olfaktornim bulbusima i dentatnom girusu, što proturječi tradicionalnim idejama o progenitornoj ulozi radijalne glije, koja ne eksprimira GFAP u dentatnom girusu u odrasloj dobi. Moguće je da postoje dvije populacije matičnih stanica u CNS-u.

Pitanje lokalizacije matičnih stanica u subventrikularnoj zoni također ostaje nejasno. Prema nekim autorima, ependimalne stanice u kulturi tvore sferne klonove koji nisu prave neurosfere (poput klonova subependimalnih stanica), budući da su sposobne diferencirati se samo u astrocite. S druge strane, nakon fluorescentnog ili virusnog označavanja ependimalnih stanica, marker se detektira u stanicama subependimalnog sloja i olfaktornih bulbica. Takve označene stanice in vitro tvore neurosfere i diferenciraju se u neurone, astrocite i oligodendrocite. Osim toga, pokazano je da oko 5% stanica u ependimi eksprimira matične markere - nestin, Notch-1 i Mussashi-1. Pretpostavlja se da je mehanizam asimetrične mitoze povezan s neravnomjernom raspodjelom membranskog receptora Notch-1, zbog čega potonji ostaje na membrani stanice kćeri lokalizirane u ependimalnoj zoni, dok je matična stanica koja migrira u subependimalni sloj lišena ovog receptora. S ovog gledišta, subependimalna zona može se smatrati kolektorom progenitornih prekursora neurona i glije nastalih iz matičnih stanica ependimalnog sloja. Prema drugim autorima, u kaudalnim dijelovima subventrikularne zone formiraju se samo glija stanice, a izvor neurogeneze su stanice rostralno-lateralnog dijela. U trećoj varijanti, prednji i stražnji dijelovi subventrikularne zone lateralnih ventrikula dobivaju ekvivalentan neurogeni potencijal.

Čini se poželjnijom četvrta varijanta organizacije matične rezerve u središnjem živčanom sustavu, prema kojoj se u subventrikularnoj zoni razlikuju tri glavne vrste neuronskih progenitorskih stanica - A, B i C. A-stanice eksprimiraju rane neuronske markere (PSA-NCAM, TuJl) i okružene su B-stanicama, koje se identificiraju kao astrociti ekspresijom antigena. C-stanice, bez antigenskih karakteristika neurona ili glije, imaju visoku proliferativnu aktivnost. Autor je uvjerljivo dokazao da su B-stanice prekursori A-stanica i de novo neurona olfaktornih bulbusa. Tijekom migracije, A-stanice su okružene nitima neuronskih progenitorskih stanica, što se značajno razlikuje od mehanizma migracije postmitotskih neuroblasta duž radijalne glije u embrionalnom mozgu. Migracija završava u olfaktornim bulbusima mitotičkom diobom i A i B stanica, čiji se derivati ugrađuju u slojeve granularnih stanica i u glomerularni sloj olfaktorne zone mozga.

Embrionalnom mozgu u razvoju nedostaju diferencirane ependimalne stanice, a stijenke ventrikula sadrže proliferirajuće matične stanice ventrikularne germinalne i subventrikularne zone, gdje migriraju primarni neuro- i glioblasti. Na temelju toga, neki autori vjeruju da subependimalna regija zrelog mozga sadrži reducirano embrionalno germinalno živčano tkivo koje se sastoji od astrocita, neuroblasta i neidentificiranih stanica. Prave živčane matične stanice čine manje od 1% stanica u germinalnoj zoni lateralne stijenke ventrikula. Djelomično zbog tog razloga, a i u vezi s podacima da su astrociti subependimalne zone prekursori živčanih matičnih stanica, nije isključena mogućnost transdiferencijacije astrocitnih glialnih elemenata stjecanjem neuronskih fenotipskih karakteristika.

Glavna prepreka konačnom rješenju problema lokalizacije živčanih matičnih stanica in vivo je nedostatak specifičnih markera za te stanice. Ipak, s praktičnog gledišta vrlo su zanimljiva izvješća da su živčane matične stanice izolirane iz regija središnjeg živčanog sustava koje ne sadrže subependimalne zone - treće i četvrte klijetke prednjeg mozga, spinalnog kanala torakalne i lumbalne regije leđne moždine. Od posebne je važnosti činjenica da ozljeda leđne moždine povećava proliferaciju ependimalnih matičnih stanica središnjeg kanala stvaranjem progenitornih stanica koje migriraju i diferenciraju se u astrocite gliomezodermalnog ožiljka. Osim toga, prekursorske stanice astro- i oligodendrocita pronađene su i u neozlijeđenoj leđnoj moždini odraslih štakora.

Dakle, podaci iz literature uvjerljivo pokazuju prisutnost u središnjem živčanom sustavu odraslih sisavaca, uključujući i ljude, regionalne matične rezerve čiji regenerativno-plastični kapacitet, nažalost, može osigurati samo procese fiziološke regeneracije stvaranjem novih neuronskih mreža, ali ne zadovoljava potrebe reparativne regeneracije. To postavlja zadatak traženja mogućnosti povećanja matičnih resursa središnjeg živčanog sustava egzogenim putem, što je nerješivo bez jasnog razumijevanja mehanizama formiranja središnjeg živčanog sustava u embrionalnom razdoblju.

Danas znamo da su tijekom embrionalnog razvoja matične stanice neuralne cijevi izvor tri vrste stanica - neurona, astrocita i oligodendrocita, tj. neuroni i neuroglija potječu iz jedne prekursorske stanice. Diferencijacija ektoderma u nakupine neuralnih progenitorskih stanica započinje pod utjecajem produkata proneuralnih gena obitelji bHLH i blokirana je ekspresijom receptorskih transmembranskih proteinskih derivata gena obitelji Notch, koji ograničavaju određivanje i ranu diferencijaciju neuralnih prekursorskih stanica. Zauzvrat, ligandi Notch receptora su transmembranski Delta proteini susjednih stanica, zbog čije izvanstanične domene se ostvaruju izravni međustanični kontakti s induktivnom interakcijom između matičnih stanica.

Daljnja provedba programa embrionalne neurogeneze nije ništa manje složena i, čini se, trebala bi biti specifična za vrstu. Međutim, rezultati studija neuroksenotransplantacije pokazuju da matične stanice imaju izražen evolucijski konzervativizam, zbog kojeg ljudske živčane matične stanice mogu migrirati i razvijati se kada se transplantiraju u mozak štakora.

Poznato je da središnji živčani sustav sisavaca ima izuzetno nizak kapacitet reparativne regeneracije, što je karakterizirano odsutnošću bilo kakvih znakova pojave novih staničnih elemenata u zrelom mozgu koji bi zamijenili neurone koji su umrli kao posljedica ozljede. Međutim, u slučaju transplantacije neuroblasta, potonji se ne samo usađuju, proliferiraju i diferenciraju, već se mogu integrirati i u moždane strukture te funkcionalno zamijeniti izgubljene neurone. Prilikom transplantacije predanih neuronskih progenitorskih stanica, terapijski učinak bio je znatno slabiji. Pokazalo se da takve stanice imaju nizak kapacitet migracije. Osim toga, neuronske progenitorske stanice ne reproduciraju arhitekturu neuronskih mreža i nisu funkcionalno integrirane u mozak primatelja. U tom smislu, aktivno se proučavaju pitanja reparativno-plastične regeneracije tijekom transplantacije nepreformiranih multipotentnih neuronskih matičnih stanica.

U studiji M. Aleksandrove i suradnika (2001.), u prvoj verziji eksperimenata, primatelji su bile spolno zrele ženke štakora, a donori 15 dana stari embriji. Dio okcipitalnog korteksa mozga uklonjen je od primatelja, a u šupljinu je transplantirano mehanički suspendirano tkivo pretpostavljenog embrionalnog korteksa koje sadrži multipotentne matične stanice ventrikularne i subventrikularne regije. U drugoj verziji eksperimenata, neuronske matične stanice 9-tjednog ljudskog embrija transplantirane su u mozak spolno zrelih štakora. Autori su izolirali komadiće tkiva iz periventrikularne regije embrionalnog mozga, stavili ih u hranjivi medij F-12 i ponovljenim pipetiranjem dobili suspenziju stanica, a zatim ih kultivirali u posebnom NPBM mediju s dodatkom faktora rasta - FGF, EGF i NGF. Stanice su uzgajane u suspenzijskoj kulturi dok se nisu formirale neurosfere, koje su dispergirane i ponovno zasađene u kulturu. Nakon 4 pasaže s ukupnim razdobljem kultivacije od 12-16 dana, stanice su korištene za transplantaciju. Primatelji su bili mladunci štakora stari deset dana i spolno zreli dvomjesečni Wistar štakori, kojima je u lateralnu klijetku mozga ubrizgano 4 μl suspenzije ljudskih živčanih matičnih stanica bez imunosupresije. Rezultati rada pokazali su da su disocirane stanice ventrikularne i subventrikularne zone embrionalnog anlagea moždane kore štakora nastavile svoj razvoj tijekom alotransplantacije u zreli mozak, tj. čimbenici mikrookruženja diferenciranog mozga primatelja nisu blokirali rast i diferencijaciju živčanih matičnih stanica embrija. U ranim fazama nakon transplantacije, multipotentne stanice nastavile su mitotičku diobu i aktivno migrirale iz područja transplantacije u moždano tkivo primatelja. Transplantirane embrionalne stanice s ogromnim migracijskim potencijalom pronađene su u gotovo svim slojevima moždane kore primatelja duž transplantacijskog puta i u bijeloj tvari. Duljina migracijskog trakta živčanih stanica uvijek je bila znatno kraća (do 680 μm) od duljine glialnih elemenata (do 3 mm). Krvne žile i vlaknaste strukture mozga služile su kao strukturni vektori za migraciju astrocita, što je zabilježeno i u drugim studijama.

Prije se vjerovalo da nakupljanje obilježenih astrocita u području oštećenja moždane kore primatelja može biti povezano s formiranjem glialne barijere između tkiva transplantata i primatelja. Međutim, proučavanje strukture kompaktno smještenih staničnih transplantata pokazalo je da njihovu citoarhitekturu karakterizira kaos, bez ikakve slojevite raspodjele transplantiranih stanica. Stupanj uređenosti transplantiranih neurona približio se onome normalnih stanica moždane kore samo u odsutnosti glialne barijere između tkiva donora i primatelja. Inače, struktura transplantiranih stanica bila je atipična, a sami neuroni bili su podložni hipertrofiji. Korištenjem neuroimunokemijskog tipiziranja transplantiranih stanica, u transplantatima su pronađeni inhibitorni GABA-ergični neuroni i otkrivena je ekspresija proteina PARV, CALB i NPY. Posljedično, zreli mozak zadržava čimbenike mikrookoliša sposobne podržati proliferaciju, migraciju i specifičnu diferencijaciju neuronskih multipotentnih stanica.

U kulturi ljudskih matičnih stanica izoliranih iz periventrikularne regije mozga 9-tjednih embrija, M. Aleksandrova i sur. (2001.) pronašli su veliki broj nestin-pozitivnih multipotentnih stanica u četvrtom pasažu, od kojih su neke već prošle in vitro diferencijaciju i razvijale su se prema neuronskom tipu, što je odgovaralo rezultatima studija drugih autora. Nakon transplantacije u mozak odraslih štakora, kultivirane ljudske matične stanice mitotički su se podijelile i migrirale u tkivo ksenogenog mozga primatelja. U transplantiranim stanicama autori su uočili dvije populacije stanica - male i veće. Potonje su migrirale i u parenhimu i duž vlaknastih struktura mozga primatelja na beznačajnim udaljenostima - unutar 300 μm. Najveći opseg migracijskog puta (do 3 mm) bio je karakterističan za male stanice, od kojih su se neke diferencirale u astrocite, što je utvrđeno korištenjem monoklonskih antitijela na GFAP. Oba tipa stanica pronađena su u stijenci lateralne klijetke, što ukazuje na to da su transplantirane stanice ušle u rostralni migracijski trakt. Astrocitni derivati neuralnih matičnih stanica i ljudi i štakora migrirali su pretežno kroz krvne kapilare i vlaknaste strukture mozga primatelja, što se podudara s podacima drugih autora.

Analiza diferencijacije ljudskih matičnih stanica in vivo korištenjem monoklonskih antitijela na GFAP, CALB i VIM otkrila je stvaranje i astrocita i neurona. Za razliku od stanica u transplantatima štakora, mnoge ljudske matične stanice bile su vimentin-pozitivne. Posljedično, neke od ljudskih multipotentnih stanica nisu podvrgnute diferencijaciji. Isti autori su naknadno pokazali da ljudske živčane matične stanice transplantirane bez imunosupresije preživljavaju u mozgu štakora 20 dana nakon transplantacije, bez znakova imunološke agresije od strane glialnih elemenata zrelog mozga.

Utvrđeno je da se čak i živčane matične stanice Drosophile usađuju i diferenciraju u mozgu taksona toliko udaljenog od insekata kao što je štakor. Ispravnost autorovog eksperimenta je neupitna: transgene linije Drosophile sadržavale su gene za ljudske neurotrofične faktore NGF, GDNF, BDNF, umetnute u CaSper vektor pod promotorom toplinskog šoka Drosophile, tako da je tjelesna temperatura sisavaca automatski izazvala njihovu ekspresiju. Autori su identificirali stanice Drosophile po produktu bakterijskog gena galaktozidaze pomoću histokemijskog X-Gal bojenja. Osim toga, pokazalo se da živčane matične stanice Drosophile specifično reagiraju na neurotrofične faktore kodirane ljudskim genima: prilikom ksenotransplantacije stanica transgene linije Drosophile koja sadrži gen gdnf, sinteza tirozin hidroksilaze u njezinim diferencirajućim živčanim matičnim stanicama naglo se povećala, a stanice s genom ngf aktivno su proizvodile acetilkolinesterazu. Ksenotransplantacija je izazvala slične genski ovisne reakcije u alotransplantatu embrionalnog živčanog tkiva transplantiranog zajedno s njom.

Znači li to da specifičnu diferencijaciju živčanih matičnih stanica induciraju neurotrofični čimbenici koji nisu specifični za vrstu? Prema rezultatima autora, neurotrofični čimbenici koji proizvode ksenograft imali su specifičan učinak na sudbinu alografta, koji su se u ovom slučaju razvijali intenzivnije i bili su 2-3 puta veći od alografta uvedenih u mozak bez dodatka ksenografta. Posljedično, ksenograftske stanice koje sadrže gene neurotrofina, posebno gen koji kodira neurotrofični faktor izveden iz ljudskih glijalnih stanica (GDNF), imaju učinak nespecifičan za vrstu na razvoj alografta sličan djelovanju odgovarajućeg neurotrofina. Poznato je da GDNF povećava preživljavanje dopaminergičnih neurona u embrionalnom srednjem mozgu štakora i pojačava metabolizam dopamina u tim stanicama, te inducira diferencijaciju stanica pozitivnih na tirozin hidroksilazu, pojačavajući rast aksona i povećavajući veličinu tijela neuronske stanice. Slični učinci uočeni su i u kultiviranim dopaminergičkim neuronima srednjeg mozga štakora.

Aktivna migracija ljudskih živčanih matičnih stanica opažena je nakon ksenotransplantacije u mozak odraslih štakora. Poznato je da proces migracije i diferencijacije živčanih matičnih stanica kontrolira skup posebnih gena. Inicijacijski signal migracije prekursorskoj stanici za početak diferencijacije daje proteinski produkt c-ret protoonkogena zajedno s GDNF-om. Sljedeći signal dolazi od gena mash-1, koji kontrolira izbor puta razvoja stanice. Osim toga, specifična reakcija stanica koje se diferenciraju također ovisi o a-receptoru cilijarnog neurotrofičnog faktora. Dakle, s obzirom na potpuno različitu genetsku konstituciju ksenogenih ljudskih živčanih matičnih stanica i stanica mozga primatelja štakora, potrebno je prepoznati ne samo nespecifičnost neurotrofičnih faktora za vrstu, već i najviši evolucijski konzervativizam gena odgovornih za specifičnu diferencijaciju elemenata živčanih matičnih stanica.

Budućnost će pokazati hoće li ksenotransplantacija embrionalnog neuromaterijala biti moguća u neurokirurškoj praksi liječenja neurodegenerativnih patoloških procesa uzrokovanih poremećajem sinteze mijelina oligodendrocitima. U međuvremenu, najintenzivnije se obrađuje pitanje neurotransplantacije koje se odnosi na dobivanje alogenih neuralnih matičnih stanica iz embrionalnog ili zrelog mozga u kulturi s njihovom naknadnom usmjerenom diferencijacijom u neuroblaste ili specijalizirane neurone.

Transplantacija živčanih matičnih stanica

Kako bi se stimulirala proliferacija i diferencijacija živčanih matičnih stanica odraslog organizma, može se transplantirati embrionalno živčano tkivo. Moguće je da matične stanice embrionalnog živčanog tkiva unesene alograftom same mogu proći proliferaciju i diferencijaciju. Poznato je da nakon ozljede kralježnice regeneracija živčanih vodiča nastaje produljenjem oštećenih aksona i kolateralnim nicanjem aksona neoštećenih nastavaka motornih neurona. Glavni čimbenici koji sprječavaju regeneraciju kralježnice su stvaranje ožiljka vezivnog tkiva u području oštećenja, distrofične i degenerativne promjene u središnjim neuronima, nedostatak NGF-a i prisutnost produkata razgradnje mijelina u području oštećenja. Pokazalo se da transplantacija različitih tipova stanica u oštećenu kralježničnu moždinu - fragmenata išijadičnog živca odraslih životinja, embrionalnog okcipitalnog korteksa, hipokampusa, kralježnične moždine, Schwannovih stanica, astrocita, mikroglije, makrofaga, fibroblasta - potiče regeneraciju oštećenih aksona nicanjem i omogućuje rast novonastalih aksona kroz zonu ozljede kralježnične moždine. Eksperimentalno je dokazano da transplantacija embrionalnog živčanog tkiva u područje ozljede leđne moždine, djelovanjem neurotrofičnih čimbenika, ubrzava rast oštećenih aksona, sprječava stvaranje glijalnog ožiljka i razvoj distrofičnih i degenerativnih procesa u središnjim neuronima, dok stanice transplantiranog embrionalnog živčanog tkiva preživljavaju u leđnoj moždini, integriraju se sa susjednim tkivima i potiču rast aksona kroz područje ozljede stvaranjem dendritičkih sinapsi na spinalnim neuronima.

Ovo područje regenerativno-plastične medicine dobilo je najveći razvoj u Ukrajini zahvaljujući radu znanstvenog tima pod vodstvom VI Tsymbalyuka. Prije svega, to su eksperimentalna istraživanja učinkovitosti transplantacije embrionalnog živčanog tkiva kod ozljeda leđne moždine. Tijekom autotransplantacije perifernog živca, autori su uočili najizraženije destruktivne promjene u distalnoj zoni šava, gdje su 30. dana nakon operacije kombinirane s reparativnim procesima. Tijekom alotransplantacije, morfofunkcionalno stanje implantiranog živca 30. dana karakteriziralo je izraženo uništenje s masnom degeneracijom i amiloidozom na pozadini fokalne upalne infiltracije limfoidnih stanica s pretežnom atrofijom Schwannovih stanica. Transplantacija embrionalnog živčanog tkiva u većoj je mjeri pridonijela obnavljanju vodljivosti leđne moždine, posebno kod životinja koje su operirane tijekom prvih 24 sata nakon ozljede: na pozadini smanjenja intenziteta upalnih i destruktivnih procesa, hipertrofije i hiperplazije ultrastrukturnih elemenata spinalnih neurona koji sintetiziraju proteine i proizvode energiju, uočena je hipertrofija i hiperplazija oligodendrocita, amplituda mišićnog akcijskog potencijala obnovljena je za 50%, a brzina provođenja impulsa za 90%. Pri procjeni učinkovitosti transplantacije embrionalnog živčanog tkiva ovisno o zoni transplantacije, utvrđeno je da su najbolji rezultati uočeni kada je transplantat uveden izravno u zonu ozljede leđne moždine. Uz potpunu transekciju leđne moždine, transplantacija embrionalnog živčanog tkiva bila je neučinkovita. Dinamičke studije pokazale su da je optimalno vrijeme za izvođenje transplantacije embrionalnog živčanog tkiva prvih 24 sata nakon ozljede leđne moždine, dok se izvođenje operacije tijekom razdoblja izraženih sekundarnih ishemijsko-upalnih promjena koje se javljaju 2.-9. dana nakon ozljede treba smatrati neprikladnim.

Poznato je da teška traumatska ozljeda mozga izaziva snažnu i produljenu aktivaciju lipidne peroksidacije u početnim i srednjim fazama posttraumatskog razdoblja, kako u oštećenom moždanom tkivu, tako i u tijelu u cjelini, te remeti procese energetskog metabolizma u ozlijeđenom mozgu. U tim uvjetima, transplantacija embrionalnog živčanog tkiva u područje traumatske ozljede potiče stabilizaciju procesa lipidne peroksidacije i povećava potencijal antioksidativnog sustava mozga i tijela u cjelini, pojačava njegovu antiradikalnu zaštitu 35.-60. dana posttraumatskog razdoblja. U istom razdoblju nakon transplantacije embrionalnog živčanog tkiva, energetski metabolizam i procesi oksidativne fosforilacije u mozgu se normaliziraju. Osim toga, pokazano je da se prvog dana nakon eksperimentalne traumatske ozljede mozga impedancija tkiva ozlijeđene hemisfere smanjuje za 30-37%, a kontralateralne za 20%, što ukazuje na razvoj generaliziranog cerebralnog edema. Kod životinja koje su podvrgnute transplantaciji embrionalnog živčanog tkiva, involucija edema dogodila se znatno brže - već sedmog dana prosječna vrijednost impedancije tkiva ozlijeđene hemisfere dosegla je 97,8% kontrolne razine. Štoviše, potpuna obnova vrijednosti impedancije 30. dana zabilježena je samo kod životinja koje su primile transplantaciju embrionalnog živčanog tkiva.

Smrt nekih neurona u mozgu nakon teške kraniocerebralne ozljede jedan je od glavnih uzroka posttraumatskih komplikacija. Neuroni integrirajućeg dopaminergičkog i noradrenergičkog sustava srednjeg mozga i produžene moždine posebno su osjetljivi na ozljede. Smanjenje razine dopamina u striopalidalnom kompleksu i moždanoj kori značajno povećava rizik od razvoja motoričkih poremećaja i mentalnih poremećaja, epileptiformnih stanja, a smanjenje proizvodnje dopamina u hipotalamusu može biti uzrok brojnih vegetativnih i somatskih poremećaja uočenih u kasnom posttraumatskom razdoblju. Rezultati studija provedenih kod eksperimentalne kraniocerebralne ozljede pokazuju da transplantacija embrionalnog živčanog tkiva pomaže u vraćanju razine dopamina u ozlijeđenoj moždanoj hemisferi, dopamina i norepinefrina u hipotalamusu te povećanju razine norepinefrina i dopamina u srednjem mozgu i produženoj moždini. Osim toga, kao rezultat transplantacije embrionalnog živčanog tkiva u ozlijeđenu hemisferu mozga pokusnih životinja, postotni omjer fosfolipida se normalizira, a sadržaj masnih kiselina se povećava (C16:0, C17:0, C17:1, C18:0, C18:1 + C18:2, C20:3 + C20:4, C20:5).

Ovi podaci potvrđuju stimulaciju regenerativno-plastičnih procesa transplantiranim embrionalnim živčanim tkivom i ukazuju na reparativno-trofički učinak transplantata na mozak primatelja u cjelini.

Kliničko iskustvo osoblja Instituta za neurokirurgiju A. P. Romodanova Akademije medicinskih znanosti Ukrajine u transplantaciji embrionalnog živčanog tkiva kod cerebralne paralize, izuzetno složene patologije s teškom motoričkom disfunkcijom, zaslužuje posebnu pozornost. Klinički oblici cerebralne paralize ovise o razini oštećenja integralnih struktura odgovornih za regulaciju mišićnog tonusa i formiranje motoričkih stereotipa. Trenutno postoji dovoljno dokaza koji podupiru činjenicu da patološke promjene u striopalidalno-talamokortikalnom sustavu motoričke kontrole igraju važnu ulogu u poremećajima motoričke funkcije i mišićnog tonusa. Striopalidalna veza ovog sustava provodi kontrolnu funkciju putem nigrostriatalne proizvodnje dopamina. Izravni put za provedbu talamokortikalne kontrole počinje od neurona putamena, posredovan je gama-aminomaslačnom kiselinom (GABA) i supstancom P te se projicira izravno u motoričku zonu unutarnjeg segmenta globus pallidusa i substantia nigra. Neizravni put, čiji se učinak ostvaruje sudjelovanjem GABA-e i enkefalina, potječe iz neurona putamena i utječe na jezgre bazalnih ganglija putem niza veza koje uključuju vanjski segment globus pallidusa i subtalamičku jezgru. Poremećaji u vodljivosti izravnog puta uzrokuju hipokineziju, dok smanjenje vodljivosti struktura neizravnog puta dovodi do hiperkinezije s odgovarajućim promjenama mišićnog tonusa. Integritet GABAergičkih putova vodljivosti na različitim razinama u sustavu motoričke kontrole i integracija dopaminergičnih veza na razini putamena bitni su za regulaciju talamokortikalnih interakcija. Najčešća manifestacija motoričke patologije u različitim oblicima cerebralne paralize je kršenje mišićnog tonusa i usko povezana promjena refleksne mišićne aktivnosti.

Transplantacija embrionalnog živčanog tkiva kod cerebralne paralize zahtijeva temeljitu analizu prirode oštećenja moždanih struktura. Na temelju određivanja razine dopamina i GABA u subarahnoidalnom cerebrospinalnom likvoru, autori su detaljno opisali razinu poremećaja integracije funkcionalnih moždanih struktura, što je omogućilo objektivizaciju rezultata kirurške intervencije i ispravljanje ponovljenih neurotransplantacija. Embrionalno živčano tkivo (materijal pobačaja 9-tjednog embrija) transplantirano je u parenhim korteksa precentralnih konvolucija moždanih hemisfera ovisno o težini atrofičnih promjena. U postoperativnom razdoblju nisu uočene komplikacije niti pogoršanje stanja pacijenata. Pozitivna dinamika zabilježena je kod 63% pacijenata sa spastičnim oblicima, kod 82% djece s atonično-estetskim oblikom, a samo kod 24% pacijenata s miješanim oblikom bolesti. Utvrđen je negativan učinak visoke razine neurosenzibilizacije uz prisutnost autoantitijela na neurospecifične proteine na rezultate operacije. Transplantacija embrionalnog živčanog tkiva pokazala se neučinkovitom kod pacijenata u dobi od 8-10 godina i starijih, kao i u slučajevima teškog hiperkinetičkog sindroma i epilepsije. Klinički, učinkovitost transplantacije embrionalnog živčanog tkiva kod pacijenata sa spastičnim oblicima cerebralne paralize očitovala se formiranjem novih statomotornih vještina i voljnih pokreta uz korekciju patološkog motoričkog stereotipa i smanjenje stupnja spastičnosti, patoloških postura i stavova. Autori smatraju da je pozitivan učinak transplantacije embrionalnog živčanog tkiva rezultat normalizirajućeg učinka na funkcionalnu aktivnost supraspinalnih struktura uključenih u regulaciju posturalnog tonusa i voljnih pokreta. Istodobno, pozitivne kliničke učinke transplantacije embrionalnog živčanog tkiva prati smanjenje sadržaja neurotransmitera u subarahnoidalnom cerebrospinalnom likvoru, što ukazuje na obnovu integralnih interakcija zahvaćenih moždanih struktura.

Postoji još jedan teški oblik neurološke patologije - apalični sindrom, čiji problem liječenja, nažalost, nije ni blizu riješen. Apalični sindrom je polietiološko subakutno ili kronično stanje koje nastaje kao posljedica teških organskih lezija središnjeg živčanog sustava (uglavnom moždane kore), a karakterizira ga razvoj panapraksije i panagnozije s relativno očuvanom funkcijom segmentalno-debelih dijelova i formacija limbičko-retikularnog kompleksa mozga. Praćenja (od 1 godine do 3 godine) pokazala su da apalični sindrom nije konačna dijagnoza perzistentnog oštećenja živčanog sustava kod djece, već se transformira ili u organsku demenciju ili u kronično vegetativno stanje. U Odjelu za restorativnu neurokirurgiju Instituta za neurokirurgiju A. P. Romodanova Akademije medicinskih znanosti Ukrajine, 21 pacijent s posljedicama apaličnog sindroma podvrgnut je transplantaciji embrionalnog živčanog tkiva. Pod općom anestezijom, krunskim svrdlom napravljena je rupa svrdla preko područja najizraženijih atrofičnih promjena otkrivenih kompjuteriziranom tomografijom ili magnetskom rezonancijom, a u prisutnosti difuzne atrofije sive ili bijele tvari, transplantat je uveden u precentralne i središnje giruse mozga. Nakon otvaranja dure mater, komadići tkiva iz senzomotornog korteksa embrija u dobi od 8-9 tjedana implantirani su intrakortikalno pomoću posebnog uređaja. Broj implantiranih uzoraka tkiva kretao se od 4 do 10, što je određivano veličinom rupe svrdla i veličinom lokalnih promjena u moždanoj tvari. Za razliku od drugih vrsta patologije, kod apaličnog sindroma autori su nastojali implantirati što više embrionalnog tkiva u najpristupačnija područja mozga. Dura mater je zašivena, a izvršena je plastična operacija defekta lubanje. Tijekom operacije, svi pacijenti pokazali su značajne promjene i u korteksu (atrofija, odsutnost konvolucija, promjena boje i pulsacije moždane tvari) i u moždanim ovojnicama (zadebljanje dure mater, značajno zadebljanje arahnoidealne membrane s prisutnošću vlastitih krvnih žila, spajanje membrana s podložnom moždanom tvari). Ove promjene bile su izraženije kod pacijenata s anamnezom upalnih lezija mozga. Kod pacijenata koji su pretrpjeli hipoksiju središnjeg živčanog sustava (CNS) prevladavale su difuzne atrofične promjene u moždanoj tvari, posebno u korteksu, s povećanjem subarahnoidnog prostora, bez značajnih promjena u moždanim ovojnicama. Polovica pacijenata imala je povećano krvarenje mekih tkiva, kostiju i moždane tvari. Nakon operacija, unutar šest mjeseci do tri godine, stanje se poboljšalo kod 16 pacijenata, a ostalo nepromijenjeno kod pet pacijenata. Pozitivna dinamika uočena je i u motoričkoj i u mentalnoj sferi. Mišićni tonus se smanjio kod deset pacijenata, a kod 11 pacijenata motorička aktivnost se povećala (smanjila se pareza,poboljšana koordinacija pokreta), kod petero djece značajno se povećala manipulativna sposobnost gornjih udova. Kod četiri pacijenta smanjila se učestalost i težina epileptičkih napadaja, a kod jednog djeteta uopće nije bilo napadaja tijekom cijelog razdoblja promatranja nakon operacije. Agresija se smanjila kod dvoje djece, kod dva pacijenta s teškim bulbarnim poremećajima poboljšao se čin gutanja, dvoje djece je već 2 tjedna nakon operacije moglo samostalno žvakati. Zabilježeno je smanjenje težine mentalnih poremećaja, devetero djece se smirilo nakon operacije, san i pažnja poboljšali su se kod sedam pacijenata. Tri pacijenta s posljedicama apaličnog sindroma počela su prepoznavati roditelje, jedan - slijediti upute, dva - izgovarati riječi, kod troje se smanjio stupanj dizartrije. Autori napominju da primjetno poboljšanje stanja pacijenata počinje 2 mjeseca nakon operacije, doseže maksimum do 5-6 mjeseci, zatim se stopa poboljšanja usporava i do kraja godine proces se stabilizira kod 50% pacijenata. Pozitivan učinak neurotransplantacije poslužio je kao osnova za ponovljenu operaciju kod šest pacijenata s posljedicama apalnog sindroma, ali na drugoj hemisferi mozga. Tehnika i metode druge transplantacije bile su identične onima kod prve operacije, ali klinički učinak druge operacije bio je manji, iako se nisu pojavile ozbiljne komplikacije ni nakon prve ni nakon druge kirurške intervencije. Prema autorima, mehanizam terapijskog učinka neurotransplantacije povezan je s neurotrofičnim učinkom transplantiranog embrionalnog živčanog tkiva, koje sadrži veliki broj tvari za rast, hormonalnih i drugih biološki aktivnih tvari koje potiču popravak oštećenih neurona i plastičnu reorganizaciju moždanog tkiva primatelja. Moguć je i aktivirajući učinak na aktivnost živčanih stanica koje su prethodno bile morfološki očuvane, ali su zbog bolesti izgubile svoju funkcionalnu aktivnost. Upravo brzi neurotrofični učinak može objasniti poboljšanje bulbarnih funkcija kod neke djece već krajem prvog ili drugog tjedna nakon operacije. Pretpostavlja se da se, osim toga, do trećeg ili četvrtog mjeseca uspostavljaju morfofunkcionalne veze između transplantata i mozga primatelja, putem kojih neurotransplantat zamjenjuje funkcije mrtvih moždanih stanica, što je supstrat za poboljšanje i motoričkih i mentalnih funkcija pacijenata. Dvoje djece moglo je samostalno žvakati već 2 tjedna nakon operacije. Zabilježeno je smanjenje težine mentalnih poremećaja, devetero djece postalo je smirenije nakon operacije, san i pažnja poboljšali su se kod sedam pacijenata. Tri pacijenta s posljedicama apaličnog sindroma počela su prepoznavati roditelje, jedan - slijediti upute, dva - izgovarati riječi.Kod troje se stupanj dizartrije smanjio. Autori primjećuju da primjetno poboljšanje stanja pacijenata počinje 2 mjeseca nakon operacije, doseže maksimum nakon 5-6 mjeseci, zatim se stopa poboljšanja usporava i do kraja godine proces se stabilizira kod 50% pacijenata. Pozitivan učinak neurotransplantacije poslužio je kao osnova za ponovljenu operaciju kod šest pacijenata s posljedicama apalnog sindroma, ali na drugoj hemisferi mozga. Tehnika i metoda druge transplantacije bile su identične onima kod prve operacije, ali klinički učinak druge operacije bio je niži, iako nije bilo ozbiljnih komplikacija ni nakon prve ni nakon druge kirurške intervencije. Prema autorima, mehanizam terapijskog učinka neurotransplantacije povezan je s neurotrofičnim učinkom transplantiranog embrionalnog živčanog tkiva, koje sadrži veliki broj tvari za rast, hormonalnih i drugih biološki aktivnih tvari koje potiču popravak oštećenih neurona i plastičnu reorganizaciju moždanog tkiva primatelja. Moguć je i aktivirajući učinak na aktivnost živčanih stanica koje su prethodno bile morfološki očuvane, ali su zbog bolesti izgubile svoju funkcionalnu aktivnost. Upravo brzi neurotrofični učinak može objasniti poboljšanje bulbarnih funkcija kod neke djece već krajem prvog ili drugog tjedna nakon operacije. Pretpostavlja se da se uz to, do trećeg ili četvrtog mjeseca, uspostavljaju morfofunkcionalne veze između transplantata i mozga primatelja, putem kojih neurotransplantat zamjenjuje funkcije mrtvih moždanih stanica, što je supstrat za poboljšanje i motoričkih i mentalnih funkcija pacijenata. Dvoje djece moglo je samostalno žvakati već 2 tjedna nakon operacije. Zabilježeno je smanjenje težine mentalnih poremećaja, devetero djece postalo je smirenije nakon operacije, san i pažnja poboljšali su se kod sedam pacijenata. Tri pacijenta s posljedicama apaličnog sindroma počela su prepoznavati roditelje, jedan - slijediti upute, dva - izgovarati riječi, kod troje se smanjio stupanj dizartrije. Autori napominju da primjetno poboljšanje stanja pacijenata počinje 2 mjeseca nakon operacije, doseže maksimum do 5-6 mjeseci, zatim se stopa poboljšanja usporava i do kraja godine proces se stabilizira kod 50% pacijenata. Pozitivan učinak neurotransplantacije poslužio je kao osnova za ponovljenu operaciju kod šest pacijenata s posljedicama apalnog sindroma, ali na drugoj hemisferi mozga. Tehnika i metoda druge transplantacije bile su identične onima kod prve operacije, ali klinički učinak druge operacije bio je niži, iako nije bilo ozbiljnih komplikacija ni nakon prve ni nakon druge kirurške intervencije. Prema autorima,Mehanizam terapijskog učinka neurotransplantacije povezan je s neurotrofičnim učinkom transplantiranog embrionalnog živčanog tkiva, koje sadrži veliki broj tvari za rast, hormonalnih i drugih biološki aktivnih tvari koje potiču popravak oštećenih neurona i plastičnu reorganizaciju moždanog tkiva primatelja. Moguć je i aktivirajući učinak na aktivnost živčanih stanica koje su prethodno bile morfološki očuvane, ali su zbog bolesti izgubile svoju funkcionalnu aktivnost. Upravo brzi neurotrofični učinak može objasniti poboljšanje bulbarnih funkcija kod neke djece već krajem prvog ili drugog tjedna nakon operacije. Pretpostavlja se da se uz to, do trećeg ili četvrtog mjeseca, uspostavljaju morfofunkcionalne veze između transplantata i mozga domaćina, putem kojih neurotransplantat zamjenjuje funkcije mrtvih moždanih stanica, što je supstrat za poboljšanje i motoričkih i mentalnih funkcija pacijenata, iako se nisu pojavile ozbiljne komplikacije ni nakon prvog ni nakon drugog kirurškog zahvata. Prema autorima, mehanizam terapijskog učinka neurotransplantacije povezan je s neurotrofičnim učinkom transplantiranog embrionalnog živčanog tkiva, koje sadrži veliki broj tvari rasta, hormonalnih i drugih biološki aktivnih tvari koje potiču popravak oštećenih neurona i plastičnu reorganizaciju moždanog tkiva primatelja. Moguć je i aktivirajući učinak na aktivnost živčanih stanica koje su prethodno bile morfološki očuvane, ali su zbog bolesti izgubile svoju funkcionalnu aktivnost. Upravo brzi neurotrofični učinak može objasniti poboljšanje bulbarnih funkcija kod neke djece već krajem prvog ili drugog tjedna nakon operacije. Pretpostavlja se da se uz to, do trećeg ili četvrtog mjeseca, uspostavljaju morfofunkcionalne veze između transplantata i mozga primatelja, putem kojih neurotransplantat zamjenjuje funkcije mrtvih moždanih stanica, što je supstrat za poboljšanje i motoričkih i mentalnih funkcija pacijenata, iako se nisu pojavile ozbiljne komplikacije ni nakon prvog ni nakon drugog kirurškog zahvata. Prema autorima, mehanizam terapijskog učinka neurotransplantacije povezan je s neurotrofičnim učinkom transplantiranog embrionalnog živčanog tkiva, koje sadrži veliki broj tvari rasta, hormonalnih i drugih biološki aktivnih tvari koje potiču popravak oštećenih neurona i plastičnu reorganizaciju moždanog tkiva primatelja. Moguć je i aktivirajući učinak na aktivnost živčanih stanica koje su prethodno bile morfološki očuvane, ali su zbog bolesti izgubile svoju funkcionalnu aktivnost.Upravo brzi neurotrofični učinak može objasniti poboljšanje bulbarnih funkcija kod neke djece već krajem prvog ili drugog tjedna nakon operacije. Pretpostavlja se da se uz to, do trećeg ili četvrtog mjeseca, uspostavljaju morfofunkcionalne veze između transplantata i mozga primatelja, putem kojih neurotransplantat nadomješta funkcije mrtvih moždanih stanica, što je supstrat za poboljšanje i motoričkih i mentalnih funkcija pacijenata.

Eksperimentalno je proučavan učinak transplantacije embrionalnog živčanog tkiva na reorganizaciju interneuronalnih međusobnih veza. Autori su proučavali obrasce obnove intermodularnih aksonskih veza u području mehaničkog oštećenja moždane kore kod bijelih štakora sa i bez transplantacije embrionalnog živčanog tkiva korištenjem fluorescentne lipofilne oznake DIL (1,1-dioktadecil-3,3,33'-tetrametilindokarbocijanin perklorat) i konfokalnog laserskog skeniranja. Utvrđeno je da uvođenje embrionalnog živčanog tkiva u područje oštećenja osigurava rast aksona, koji se nakon prolaska kroz transplantat spajaju sa susjednim moždanim tkivom, dok je bez transplantacije embrionalnog živčanog tkiva područje oštećenja nepremostiva prepreka za rast aksona. U ovom radu provedena je transplantacija embrionalnog (15.-17. dan gestacije) neokorteksa. Rezultati koje su autori dobili daljnji su dokaz u prilog aktivnom utjecaju transplantacije embrionalnog živčanog tkiva na posttraumatsku reorganizaciju interneuronalnih odnosa susjednih strukturnih i funkcionalnih modula moždane kore. Transplantacija embrionalnog živčanog tkiva omogućuje djelomičnu obnovu veza između oštećenih područja moždane kore stvaranjem povoljnih uvjeta za rast aksona u zoni djelovanja neurotrofičkih čimbenika transplantata. Postojanje takvog učinka eksperimentalno je dokazano i u literaturi se raspravlja kao dokaz visokih plastičnih sposobnosti oštećenog mozga spolno zrelih životinja. U tom smislu, transplantacija stanica trenutno se smatra optimalnom terapijskom strategijom za vraćanje funkcije oštećenog ljudskog CNS-a.

Podaci koje su autori dobili o učinkovitosti korištenja embrionalnog živčanog tkiva mozga kao egzogenog transplantacijskog medija za rast aksona potvrđuju izglede za ciljano stvaranje komunikacijskih veza između neoštećenih susjednih područja mozga. Rad na proučavanju učinka transplantacije živčanog tkiva na dinamiku funkcionalnih parametara središnjeg živčanog sustava čini se relevantnim. Zadatak rada bio je istražiti učinak transplantacije embrionalnog locus coeruleus (LC) na morfofunkcionalne indekse LC neurona i lokomotornu aktivnost primatelja. Primatelji su bili ženke Wistar štakora, a donori 18-dnevni embriji štakora iste linije. Transplantacija embrionalnog LC provedena je u šupljinu treće moždane klijetke. Histološki, usađivanje presatka otkriveno je kod 75% životinja primatelja. U slučajevima usađivanja, presatak je bio uz stijenku klijetke, ispunjavajući 1/5-2/5 njezina lumena i bio je održiv. 1 i 6 mjeseci nakon operacije, transplantirano živčano tkivo, prema svojim morfološkim karakteristikama, predstavljalo je strukture koje bi nastale tijekom njihovog normalnog ontogenetskog razvoja, tj. LC strukture. Podaci koje su autori dobili ukazuju na to da se kod životinja kojima je transplantiran embrionalni LC začetak mijenja dinamička aktivnost i povećava matrična aktivnost kromatina jezgri LC stanica. Posljedično, aktivnost neurona vlastite LC stanice se pojačava, ali je i usađeni transplantat funkcionalno aktivan. Poznato je da se tzv. lokomotorna regija srednjeg mozga praktički podudara s lokalizacijom LC. Autori smatraju da je osnova za promjenu motoričke aktivnosti štakora primatelja aktivacija LC stanica, kako vlastitih tako i transplantiranih, s oslobađanjem velike količine norepinefrina, uključujući i u segmentima leđne moždine. Stoga se pretpostavlja da je povećanje motoričke aktivnosti u uvjetima transplantacije LC u netaknuti mozak životinja posljedica prisutnosti funkcionalno aktivnog transplantata integriranog s mozgom primatelja i koji doprinosi aktivaciji lokomotorne aktivnosti kod štakora.

Osim toga, pokazano je da transplantirane neuroepitelne stanice embrionalnih rudimenta neokorteksa i leđne moždine preživljavaju i diferenciraju se u neuroblaste, mlade i zrele neurone unutar 1-2 mjeseca nakon transplantacije u oštećeni išijatični živac zrelih štakora. Prilikom proučavanja dinamike razvoja NADPH-pozitivnih neurona embrionalnih rudimenta neokorteksa i leđne moždine štakora u heterotopnim alograftima (15-dnevni štakorski embrij), na uzdužnim presjecima kroz išijatični živac štakora primatelja otkriveno je usađivanje 70 do 80% neurograftova, što je ovisilo o razdoblju promatranja. Uni- i bipolarni neuroblasti sa zaobljenim svijetlim jezgrama i jednom ili dvije nukleoluse počeli su se formirati u graftovima tjedan dana nakon operacije, što je bilo popraćeno stvaranjem nakupina. Autori nisu uspjeli otkriti stanice koje sadrže NADPH dijaforazu (NADPH-d) među neuroblastima. Nakon 7 dana, samo su stanični elementi krvnih žila bili NADPH-pozitivni - kapilarne endotelne stanice u debljini transplantata, kao i endotelne i glatkomišićne stanice žila išijadičnog živca primatelja. Budući da se u stanicama glatkih mišića krvnih žila indukcija NO sintaze (NOS) događa pod utjecajem IL-1, autori povezuju pojavu NADPH-pozitivnih glatkomišićnih stanica u krvnim žilama išijadičnog živca s prisutnošću IL-1 sintetiziranog u oštećenim živčanim stablima. Poznato je da se neurogeneza u uvjetima transplantacije embrionalnih rudimenta mozga događa sinkrono s razvojem neurona in situ. Rezultati morfoloških studija pokazuju da diferencijacija nekih neuronskih elemenata transplantata sedam dana nakon transplantacije odgovara diferencijaciji stanica u sličnim dijelovima mozga novorođenih štakora. Dakle, u uvjetima heterotopne transplantacije u periferni živac, transplantirane embrionalne živčane stanice pokazuju sposobnost sinteze NADPH-d. U ovom slučaju, više neurona koji sadrže NADPH-d nalazi se u transplantatima leđne moždine nego u transplantatima neokorteksa, ali sinteza dušikovog oksida počinje u transplantiranim neuronima kasnije nego tijekom razvoja in situ. U središnjem živčanom sustavu kralježnjaka, NOS-pozitivne stanice pojavljuju se već u prenatalnom razdoblju. Smatra se da NO potiče stvaranje sinaptičkih veza u mozgu u razvoju, a prisutnost NOS-pozitivnih živčanih aferentnih vlakana koja osiguravaju sintezu NO u cerebelarnim neuroblastima stimulira migraciju i diferencijaciju neurona, zbog čega se formira normalna citoarhitektura mozga. U tektumu je utvrđena važna uloga NO u sinapsogenezi - samo su oni neuroni koji su imali sinaptičke veze sa stanicama mrežnice pokazali se NOS-pozitivnima.

Poznato je da je dušikov oksid jedan od regulatora moždane aktivnosti, gdje se formira iz arginina pod utjecajem NO sintaze, koja ima dijaforazu. U središnjem živčanom sustavu, NO se sintetizira u endotelnim stanicama krvnih žila, mikrogliji, astrocitima i neuronima različitih dijelova mozga. Nakon traumatske ozljede mozga, kao i tijekom hipoksije i ishemije, opaža se povećanje broja neurona koji sadrže NO, koji je jedan od regulatora cerebralnog protoka krvi. S obzirom na sposobnost NO da inducira sinapsogenezu, od posebnog je interesa proučavanje stvaranja stanica koje sadrže NO u uvjetima neurotransplantacije na pozadini traumatskog oštećenja živčanog tkiva primatelja.

Ništa manje važno nije ni proučavanje utjecaja neurotransplantacije na uvjetni refleksni stereotip ponašanja. U eksperimentima proučavanja utjecaja intracerebralne i distantne (između CII i CIII) transplantacije tkiva embrionalnog locus coeruleusa (17-19 dana gestacije) na procese pamćenja i sadržaj kateholamina kod štakora s uništavanjem frontotemporalnog neokorteksa, pokazano je da elektrolitičko oštećenje frontotemporalnog korteksa mozga remeti stereotip uvjetne refleksne emocionalne reakcije izbjegavanja (pamćenja), slabi fiziološku aktivnost, smanjuje sadržaj norepinefrina u zoni koaguliranog neokorteksa, ali povećava njegovu razinu u hipotalamusu, gdje se opaža smanjenje koncentracije adrenalina, iako se njegova količina u krvi i nadbubrežnim žlijezdama povećava.

Kao rezultat intracerebralne transplantacije tkiva embrionalnog locus coeruleusa, stereotip uvjetovane refleksne emocionalne reakcije izbjegavanja, poremećen elektrolitičkim oštećenjem frontotemporalnih regija moždane kore, obnavlja se kod 81,4% životinja, normalizira se sadržaj adrenalina u retikularnoj formaciji srednjeg mozga, hipotalamusa i neokorteksa, a njegova razina u hipokampusu čak se povećava, što je kombinirano sa smanjenjem koncentracije adrenalina u krvi.

Udaljena transplantacija tkiva embrionalnog locus coeruleusa ne samo da obnavlja poremećeni stereotip uvjetovane refleksne emocionalne izbjegavajuće reakcije kod štakora s elektrolitičkim oštećenjem frontotemporalnog korteksa, već i povećava sadržaj norepinefrina i adrenalina, uglavnom u hipotalamusu, krvi, nadbubrežnim žlijezdama i srcu. Pretpostavlja se da je to zbog vaskularizacije transplantata, prodiranja neurotransmitera u krvotok, njihovog prolaska kroz krvno-moždanu barijeru i aktivacije mehanizama ponovnog preuzimanja adrenalina i norepinefrina tipovima preuzimanja 1, 2, 3. Autori smatraju da se dugotrajna stabilizacija razine norepinefrina u uvjetima prihvaćanja i funkcioniranja transplantata može smatrati fenomenom njegovog progresivnog oslobađanja u minimalnim dozama od strane neurona locus coeruleusa.

Pozitivni klinički učinci transplantacije embrionalnog živčanog tkiva mogu se pripisati i sposobnosti potonjeg da utječe na procese vaskularne neoplazme, u čijoj regulaciji izravno sudjeluju faktori rasta i citokini. Vaskulogenezu aktiviraju angiogeni faktori rasta - faktor rasta vaskularnog endotela (VEGF), FGF, PDGF i TGF, koji se sintetiziraju tijekom ishemije, što djeluje kao inicijacijski trenutak angiogeneze. Dokazano je da se iscrpljivanje potencijala rasta krvnih žila događa tijekom procesa starenja tijela, što igra značajnu ulogu u patogenezi bolesti poput koronarne bolesti srca i obliterirajuće ateroskleroze donjih ekstremiteta. Ishemija tkiva razvija se i kod mnogih drugih bolesti. Uvođenje angiogenih faktora u ishemijske zone (terapijska angiogeneza) stimulira rast krvnih žila u ishemijskim tkivima i poboljšava mikrocirkulaciju zbog razvoja kolateralne cirkulacije, što, pak, povećava funkcionalnu aktivnost zahvaćenog organa.

VEGF i FGF smatraju se najperspektivnijima za kliničku primjenu. Rezultati prvih randomiziranih studija bili su ohrabrujući, posebno ako su optimalne doze i metode primjene angiogenih faktora ispravno odabrane. U tom smislu provedena je eksperimentalna procjena angiogene aktivnosti ekstrakta izoliranog iz ljudskog embrionalnog moždanog tkiva. U radu je korišten pobačeni materijal dobiven u dvadesetom tjednu trudnoće i obrađen prema metodi I. Macioga i suradnika (1979.) kako ju je modificirao IC ANRF. Ovaj lijek je analog „Dodatka za rast endotelnih stanica“ („Sigma“) i prirodna je mješavina ljudskih angiogenih faktora, koja uključuje VEGF i FGF. Eksperimenti su provedeni na štakorima s modelima ishemije stražnjih udova i tkiva miokarda. Na temelju proučavanja aktivnosti alkalne fosfataze kod eksperimentalnih životinja kojima je dan ekstrakt embrionalnog živčanog tkiva, utvrđeno je povećanje broja kapilara po jedinici površine miokarda - i u uzdužnim i u poprečnim presjecima srca. Angiogena aktivnost pripravka očitovala se izravnom primjenom u ishemičnu zonu, kao i u slučaju sistemske (intramuskularne) primjene, što je dovelo do smanjenja prosječne površine postinfarktnog ožiljka.

U bilo kojoj varijanti transplantacije embrionalnog živčanog tkiva izuzetno je važno pravilno odabrati gestacijsku dob transplantiranog embrionalnog materijala. Komparativna analiza učinkovitosti staničnih pripravaka iz embrionalnog ventralnog mezencefalona 8-, 14- i 16-17-dnevnih štakorskih embrija tri mjeseca nakon intrastriatalne neurotransplantacije zrelim štakorima s parkinsonizmom u automatiziranom testu motorne asimetrije inducirane apomorfinom otkrila je značajno veću učinkovitost staničnih pripravaka središnjeg živčanog sustava iz 8-dnevnih embrija i najnižu učinkovitost iz 16-17-dnevnog embrionalnog živčanog tkiva. Dobiveni podaci korelirali su s rezultatima histomorfološke analize, posebno s veličinom transplantata, težinom glialne reakcije i brojem dopaminergičnih neurona u njima.

Razlike u terapijskom učinku stanica embrionalnog živčanog tkiva mogu biti povezane i sa stupnjem nezrelosti i predanosti samih stanica i s njihovim različitim odgovorima na faktore rasta oslobođene u području induciranog oštećenja dopaminergičnih neurona. Posebno, učinak EGF-a i FGF2 na razvoj telencefalnih živčanih matičnih stanica in vivo javlja se u različitim fazama embriogeneze. Neuroepitelne stanice mišjih embrija starih 8,5 dana, kada se uzgajaju in vitro u mediju bez seruma, proliferiraju u prisutnosti FGF2, ali ne i EGF-a, na koji reagiraju samo populacije matičnih stanica izoliranih iz mozga embrija u kasnijim fazama razvoja. Istodobno, živčane matične stanice proliferiraju kao odgovor na svaki od ovih mitogena i aditivno pojačavaju rast u slučaju dodavanja EGF-a i FGF2 u kulturu s niskom gustoćom sjetve stanica. EGF-reaktivne živčane matične stanice iz germinativnih zona mišjih embrija starih 14,5 dana smatraju se linearnim potomcima FGF-reaktivnih živčanih matičnih stanica koje se prvi put pojavljuju nakon 8,5 dana gestacije. Potencijalni fenotip živčanih matičnih i progenitorskih stanica ovisi o složenom učinku njihovog mikrookruženja. Imunofenotipizacija živčanih stanica iz periventrikularne i hipokampalne zone ljudskih embrija starih 8-12 i 17-20 tjedana protočnom citofluorometrijom otkrila je značajnu varijabilnost povezanu s gestacijskom dobi i individualnim konstitucijskim značajkama donorskog biomaterijala. Kada se ove živčane progenitorske stanice uzgajaju u selektivnom mediju bez seruma s EGF-om, FGF2 i NGF-om, neurosfere se formiraju brzinom koja značajno ovisi o gestacijskoj dobi. Stanice iz različitih dijelova mozga ljudskih embrija starih 5-13 tjedana, kada se kratko kultiviraju s FGF2 u monoslojnoj kulturi na lamininskom supstratu u prisutnosti tragova faktora rasta, održavaju proliferaciju tijekom 6 tjedana s visokim postotkom nestin-pozitivnih stanica na pozadini spontanog stvaranja stanica s markerima sve tri linije neuralne diferencijacije. Stanice izolirane iz mezencefalona ljudskog embrija u razdoblju gestacije duljem od 13 tjedana proliferiraju pod utjecajem EGF-a i također formiraju neurosfere. Sinergistički učinak postignut je korištenjem kombinacije EGF-a i FGF2. Najintenzivnija proliferacija neuralnih matičnih stanica s formiranjem neurosfera uočena je pri kultiviranju tkiva moždane kore ljudskih embrija starih 6-8 tjedana u prisutnosti EGF2, IGF1 i 5% konjskog seruma na supstratu s fibronektinom.

Treba napomenuti da pitanja koja se tiču gestacijske dobi i dijela embrionalnog središnjeg živčanog sustava, čije je tkivo poželjnije koristiti u svrhu neurotransplantacije, ostaju otvorena. Odgovore na njih treba tražiti u neurogenezi mozga u razvoju, koja se nastavlja tijekom cijelog prenatalnog razdoblja - u vrijeme kada epitel neuralne cijevi formira višeslojnu strukturu. Smatra se da je izvor matičnih stanica i novih neurona radijalna glija, koja se sastoji od izduženih stanica s dugim nastavcima radijalno usmjerenim u odnosu na stijenku moždanih vezikula i dodiruje unutarnju površinu ventrikula i vanjsku pialnu površinu moždane stijenke. Prije je radijalna glija bila obdarena samo funkcijom neuronskog trakta duž kojeg neuroblasti migriraju iz ventralne regije u površinske dijelove, a dodijeljena joj je i skeletna uloga u procesu formiranja ispravne laminarne organizacije korteksa. Danas je utvrđeno da se, kako razvoj napreduje, radijalna glija transdiferencira u astrocite. Značajan dio kod sisavaca se smanjuje odmah nakon rođenja, međutim, kod onih životinjskih vrsta kod kojih je radijalna glija sačuvana do odrasle dobi, neurogeneza se aktivno odvija u postnatalnom razdoblju.

U kulturi, radijalne glialne stanice iz embrionalnog neokorteksa glodavaca formirale su neurone i glialne stanice, pri čemu su se neuroni pretežno formirali u gestacijskoj dobi razvoja embrija od 14 do 16 dana (razdoblje maksimalnog intenziteta neurogeneze u moždanoj kori miševa i štakora). 18. dana embriogeneze, diferencijacija se pomaknula prema formiranju astrocita sa značajnim smanjenjem broja novonastalih neurona. In situ označavanje radijalnih glialnih stanica s GFP-om omogućilo je otkrivanje asimetrične diobe označenih stanica u šupljini moždanih vezikula 15 do 16 dana starih embrija štakora s pojavom stanica kćeri s imunološkim i elektrofiziološkim karakteristikama neuroblasta. Vrijedno je napomenuti da, prema rezultatima dinamičkih promatranja, nastali neuroblasti koriste matičnu stanicu radijalnih glialnih stanica za migraciju na pialnu površinu.

Endogeni marker radijalne glije je intermedijarni filamentni protein nestin. Korištenjem metode fluorescentnog protočnog sortiranja stanica označenih retrovirusom povezanim s GFP-om i eksprimiranim pod kontrolom nestina, pokazano je da matične stanice dentatnog girusa i hilusa ljudskog hipokampusa (materijal je dobiven tijekom operacija epilepsije) eksprimiraju nestin. Stoga pripadaju radijalnoj gliji, koja je kod ljudi, kao i kod drugih sisavaca, sačuvana samo u dentatnom girusu.

Istovremeno, učinkovitost transplantacije stanica određena je ne samo visokom vijabilnošću donorskih stanica, njihovim potencijalom diferencijacije i sposobnošću zamjene defektnih stanica, već, prije svega, njihovom usmjerenom migracijom. Potpuna funkcionalna integracija transplantiranih stanica ovisi o njihovoj sposobnosti migracije - bez narušavanja citoarhitekture mozga primatelja. Budući da radijalna glija prolazi gotovo potpunu redukciju u postnatalnom razdoblju, bilo je potrebno otkriti kako se donorske stanice mogu kretati iz zone transplantacije do mjesta oštećenja mozga kod odraslih primatelja. Postoje dvije varijante migracije stanica u središnji živčani sustav koje ne ovise o radijalnoj gliji: fenomen tangencijalne migracije ili kretanje neuroblasta tijekom razvoja moždane kore okomito na mrežu radijalne glije, kao i migracija "u nizu" ili "duž lanca". Konkretno, migracija neuronskih progenitorskih stanica iz rostralne subventrikularne zone u olfaktorni žarulj događa se kao niz čvrsto susjednih stanica okruženih glijalnim stanicama. Vjeruje se da te stanice koriste partnerske stanice kao migracijski supstrat, a glavni regulator takvih međustaničnih interakcija je PSA-NCAM (polisializirana molekula adhezije neuronskih stanica). Stoga, migracija neurona ne zahtijeva nužno sudjelovanje radijalne glije ili već postojećih aksonskih veza. Ekstraradijalni oblik kretanja stanica u „nizu“ duž rostralnog migracijskog trakta održava se tijekom cijelog života, što ukazuje na stvarnu mogućnost ciljane isporuke transplantiranih neuronskih progenitorskih stanica u zreli živčani sustav.

Postoji hipoteza o prisutnosti linije matičnih stanica u ontogenezi mozga, prema kojoj je u ranim fazama razvoja mozga matična stanica neuroepitelna stanica koja se, kako sazrijeva, transdiferencira u radijalnu gliju. U odrasloj dobi ulogu matičnih stanica obavljaju stanice koje imaju karakteristike astrocita. Unatoč nizu kontroverznih točaka (kontradikcije u vezi s matičnim stanicama hipokampusa, kao i dubokim dijelovima mozga koji nemaju slojeviti korteks i razvijaju se iz talamičkih tuberkula, gdje radijalna glija nije prisutna), jasan i jednostavan koncept dosljedne promjene fenotipa matičnih stanica tijekom ontogeneze izgleda vrlo privlačno.

Utjecaj mikrookolišnih čimbenika na određivanje i naknadnu diferencijaciju neuronskih diferencijalnih stanica jasno je demonstriran transplantacijom zrelih matičnih stanica leđne moždine štakora u različite regije zrelog živčanog sustava. Kada su matične stanice transplantirane u dentatni girus ili u područje migracije neurona u olfaktornim bulbusima, uočena je aktivna migracija transplantiranih stanica, uz stvaranje brojnih neurona. Transplantacija matičnih stanica u leđnu moždinu i regiju Ammonovog roga rezultirala je stvaranjem astrocita i oligodendrocita, dok je transplantacija u dentatni girus rezultirala stvaranjem ne samo glialnih stanica, već i neurona.

U zrelog štakora, broj stanica koje se dijele u dentatnom girusu može doseći nekoliko tisuća dnevno - manje od 1% ukupnog broja granularnih stanica. Neuroni čine 50-90% stanica, astociti i ostali glijalni elementi - oko 15%. Preostale stanice nemaju antigenska obilježja neurona i glije, ali sadrže antigene endotelnih stanica, što ukazuje na blisku vezu između neurogeneze i angiogeneze u dentatnom girusu. Zagovornici mogućnosti diferencijacije endotelnih stanica u neuronske prekursorske stanice pozivaju se na sposobnost endotelnih stanica in vitro da sintetiziraju BDNF.

Brzina samosastavljanja neuronskih krugova je impresivna: tijekom diferencijacije, prekursorske stanice granularnih stanica migriraju u dentatni girus i formiraju nastavke koji rastu prema SAZ zoni Ammonovog roga i formiraju sinapse s piramidalnim glutamatergičkim i interkalarnim inhibitornim neuronima. Novostvorene granularne stanice integriraju se u postojeće neuronske krugove unutar 2 tjedna, a prve sinapse pojavljuju se već 4-6 dana nakon pojave novih stanica. Čestom primjenom BrdU ili 3H-timidina (jedna od metoda za identifikaciju odraslih matičnih stanica) zrelim životinjama, u Ammonovom rogu pronađen je veliki broj obilježenih neurona i astrocita, što ukazuje na mogućnost formiranja novih neurona ne samo u dentatnom girusu, već i u drugim dijelovima hipokampusa. Interes za procese diobe, diferencijacije i stanične smrti u dentatnom girusu hipokampusa zrelog mozga posljedica je i činjenice da su neuroni koji se ovdje formiraju lokalizirani u jednom od ključnih područja hipokampusa, odgovornom za procese učenja i pamćenja.

Dakle, danas je utvrđeno da neuralne progenitorske stanice potječu iz stanica subependimalne zone lateralne klijetke odraslih glodavaca. One migriraju duž rostralnog migracijskog trakta koji tvore longitudinalno orijentirane astroglijske stanice do olfaktornog bulbusa, gdje se ugrađuju u sloj granularnih stanica i diferenciraju u neurone ove strukture. Migracija progenitorskih neuralnih stanica otkrivena je u rostralnom migracijskom traktu odraslih majmuna, što ukazuje na mogućnost stvaranja novih neurona u olfaktornom bulbusu primata. Neuralne matične stanice izolirane su iz olfaktornog bulbusa odraslog čovjeka i prenesene u linije, čije se klonirane stanice diferenciraju u neurone, astrocite i oligodendrocite. Matične stanice pronađene su u hipokampusu zrelog mozga štakora, miševa, majmuna i ljudi. Neuralne matične stanice subgranularne zone dentatne fascije izvor su progenitorskih stanica koje migriraju u medijalne i lateralne udove hipokampusa, gdje se diferenciraju u zrele granularne stanice i glija elemente. Aksoni de novo formiranih neurona dentatne fascije prate se do CA3 polja, što ukazuje na sudjelovanje novo formiranih neurona u provedbi hipokampalnih funkcija. U asocijativnim područjima neokorteksa odraslih majmuna pronađene su neuronske progenitorske stanice koje migriraju iz subventrikularne zone. U sloju VI neokorteksa mišjeg mozga, novi piramidalni neuroni detektirani su 2-28 tjedana nakon induciranog oštećenja i smrti izvornih neurona ovog sloja zbog migracije prethodno uspavanih progenitorskih stanica subventrikularne zone. Konačno, stvarnost postnatalne neurogeneze u ljudskom mozgu dokazuje se dvostrukim povećanjem broja kortikalnih neurona, koje se nastavlja tijekom prvih 6 godina nakon rođenja.

Od ne male važnosti za praktičnu transplantaciju stanica je pitanje regulacije procesa reprodukcije i diferencijacije živčanih matičnih i progenitorskih stanica. Najvažniji čimbenici koji potiskuju proliferaciju živčanih progenitorskih stanica su glukokortikoidi, koji oštro smanjuju broj dioba, dok uklanjanje nadbubrežnih žlijezda, naprotiv, značajno povećava broj mitoza (Gould, 1996). Vrijedno je napomenuti da je morfogeneza dentatnog girusa kod glodavaca najintenzivnija tijekom prva dva tjedna postnatalnog razvoja u razdoblju odsutnosti reakcije na stres na pozadini oštrog smanjenja proizvodnje i lučenja steroidnih hormona kore nadbubrežne žlijezde. Kortikosteroidi inhibiraju migraciju granularnih stanica - novi neuroni se ne ugrađuju u granularni sloj dentatnog girusa, već ostaju u hilusu. Pretpostavlja se da su istovremeno poremećeni procesi stvaranja sinaptičkih veza. Zaštita stanica od takve „steroidne agresije“ provodi se minimalnom ekspresijom mineralokortikoidnih i glukokortikoidnih receptora na proliferirajućim granularnim stanicama ne samo tijekom razvoja dentatnog girusa, već i kod odraslih životinja. Međutim, od svih neurona mozga, neuroni hipokampusa karakteriziraju se najvećim sadržajem glukokortikoidnih receptora, što uzrokuje stresni učinak na hipokampus. Psihoemocionalni stres i stresne situacije inhibiraju neurogenezu, a kronični stres oštro smanjuje sposobnost životinja da stječu nove vještine i uče. Izraženiji negativan učinak kroničnog stresa na neurogenezu sasvim je razumljiv ako uzmemo u obzir pretežno uspavano stanje živčanih matičnih stanica. Prilikom imobilizacije gravidnih štakora (za glodavce - izuzetno jak faktor stresa), utvrđeno je da prenatalni stres također uzrokuje smanjenje broja stanica u dentatnom girusu i značajno inhibira neurogenezu. Poznato je da glukokortikoidi sudjeluju u patogenezi depresivnih stanja, čiji je morfološki ekvivalent inhibicija neurogeneze, patološka reorganizacija neurona i interneuronalnih veza te smrt živčanih stanica. S druge strane, antidepresivni kemoterapijski agensi aktiviraju stvaranje neurona de novo, što potvrđuje vezu između procesa stvaranja novih neurona u hipokampusu i razvoja depresije. Estrogeni imaju značajan utjecaj na neurogenezu, čiji su učinci suprotni djelovanju glukokortikosteroida i sastoje se u podržavanju proliferacije i održivosti neuronskih progenitorskih stanica. Treba napomenuti da estrogeni značajno povećavaju sposobnost učenja kod životinja. Neki autori povezuju cikličke promjene u broju granularnih stanica i njihov višak kod ženki s utjecajem estrogena.

Poznato je da neurogenezu kontroliraju EGF, FGF i BDNF, međutim, mehanizmi utjecaja vanjskih signala na matične stanice iz mitogena i faktora rasta nisu dovoljno proučeni. Utvrđeno je da PDGF in vitro održava neuronski smjer diferencijacije progenitorskih stanica, a cilijarni neurotrofični faktor (CNTF), poput trijodtironina, stimulira stvaranje pretežno glijalnih elemenata - astrocita i oligodendrocita. Protein koji aktivira adenilat ciklazu hipofize (PACAP) i vazoaktivni crijevni peptid (VIP) aktiviraju proliferaciju neuronskih progenitorskih stanica, ali istovremeno inhibiraju procese diferencijacije stanica kćeri. Opioidi, posebno u slučaju njihove dugotrajne izloženosti, značajno inhibiraju neurogenezu. Međutim, opioidni receptori nisu identificirani u matičnim stanicama i neuronskim progenitorskim stanicama dentatnog girusa (prisutni su u diferencirajućim neuronima embrionalnog razdoblja), što nam ne omogućuje procjenu izravnih učinaka opioida.

Potrebe praktične regenerativno-plastične medicine prisilile su istraživače da posebnu pozornost posvete proučavanju pluri- i multipotentnosti matičnih stanica. Primjena ovih svojstava na razini regionalnih matičnih stanica odraslog organizma u budućnosti bi mogla osigurati proizvodnju potrebnog transplantacijskog materijala. Gore je pokazano da epigenetička stimulacija živčanih matičnih stanica omogućuje dobivanje proliferirajućih stanica koje su već preformirane prema živčanim fenotipovima, što ograničava njihov broj. U slučaju korištenja totipotentnih svojstava embrionalne matične stanice, proliferacija dok se ne dobije dovoljan broj stanica događa se ranije od živčane diferencijacije, a umnožene stanice se lako pretvaraju u živčani fenotip. Za dobivanje živčanih matičnih stanica, ESC se izoliraju iz unutarnje stanične mase blastociste i uzgajaju u obveznoj prisutnosti LIF-a, koji čuva njihovu totipotentnost i sposobnost neograničene diobe. Nakon toga, inducira se živčana diferencijacija ESC pomoću retinoične kiseline. Transplantacija rezultirajućih živčanih matičnih stanica u striatum oštećen kinolinom i 6-hidroksidopaminom popraćena je njihovom diferencijacijom u dopaminergičke i serotonergične neurone. Nakon injekcije u ventrikule embrionalnog mozga štakora, neuronske progenitorske stanice izvedene iz ESC-a migriraju u različite regije mozga primatelja, uključujući korteks, striatum, septum, talamus, hipotalamus i mali mozak. Stanice koje ostaju u ventrikularnoj šupljini tvore epitelne strukture koje nalikuju neuralnoj cijevi, kao i pojedinačne otoke ne-neuralnog tkiva. U moždanom parenhimu embrija primatelja, transplantirane stanice proizvode tri glavna tipa stanica živčanog sustava. Neke od njih imaju izdužene apikalne dendrite, piramidalna stanična tijela i bazalne aksone koji se projiciraju u corpus callosum. Astrociti donorskog podrijetla produžuju nastavke do obližnjih kapilara, a oligodendrociti blisko dodiruju mijelinske mufove, sudjelujući u stvaranju mijelina. Dakle, neuronske progenitorske stanice dobivene iz ESC-a in vitro sposobne su za usmjerenu migraciju i regionalnu diferencijaciju adekvatnu signalima mikrookoliša, opskrbljujući mnoga područja mozga u razvoju neuronima i glijom.

Neki autori razmatraju mogućnost de- i transdiferencijacije regionalnih matičnih stanica odraslog organizma. Neizravnu potvrdu dediferencijacije stanica u kulturi s proširenjem njihovih potencijala pružaju podaci o usađivanju mišjih živčanih matičnih stanica u crvenu koštanu srž s naknadnim razvojem staničnih linija iz njih, što daje funkcionalno aktivne stanice periferne krvi. Osim toga, transplantacija genetski obilježenih (LacZ) stanica neurosfere dobivenih iz zrelog ili embrionalnog mozga u mozak ozračenih miševa s potisnutom hematopoezom dovela je do stvaranja ne samo živčanih derivata iz matičnih stanica, već je uzrokovala i stvaranje krvnih stanica, što ukazuje na pluripotentnost živčanih matičnih stanica, ostvarenu izvan mozga. Dakle, živčana matična stanica sposobna je diferencirati se u krvne stanice pod utjecajem signala iz mikrookruženja koštane srži s prethodnom transformacijom u hematopoetsku matičnu stanicu. S druge strane, prilikom transplantacije hematopoetskih matičnih stanica koštane srži u mozak utvrđena je njihova diferencijacija pod utjecajem mikrookruženja moždanog tkiva u glialne i živčane stanice. Posljedično, potencijal diferencijacije živčanih i hematopoetskih matičnih stanica nije ograničen specifičnošću tkiva. Drugim riječima, čimbenici lokalnog mikrookruženja, različiti od onih karakterističnih za tkivo mozga i koštane srži, sposobni su promijeniti smjer diferencijacije tih stanica. Pokazalo se da živčane matične stanice unesene u venski sustav ozračenih miševa stvaraju populacije mijeloidnih, limfoidnih i nezrelih hematopoetskih stanica u slezeni i koštanoj srži. In vitro je utvrđen učinak morfogenetskih proteina koštane srži (BMP) na preživljavanje i diferencijaciju živčanih matičnih stanica, određujući, kao i u ranim fazama embriogeneze, njihov razvoj u živčanom ili glijalnom smjeru. U kulturama živčanih matičnih stanica iz 16 dana starih embrija štakora, BMP induciraju stvaranje neurona i astroglije, dok se u kulturama matičnih stanica dobivenih iz perinatalnog mozga stvaraju samo astrociti. Osim toga, BMP potiskuju stvaranje oligodendrocita, koji se in vitro pojavljuju samo uz dodatak antagonista BMP-a noggina.

Procesi transdiferencijacije nisu specifični za vrstu: hematopoetske matične stanice ljudske koštane srži transplantirane u striatum zrelih štakora migriraju u bijelu tvar vanjske kapsule, ipsi- i kontralateralnog neokorteksa, gdje tvore stanične elemente slične astrocitima (Azizi i sur., 1998.). Kada se matične stanice koštane srži alotransplantiraju u lateralnu klijetku novorođenih miševa, migracija hematopoetskih matičnih stanica može se pratiti do struktura prednjeg mozga i malog mozga. U striatumu i molekularnom sloju hipokampusa migrirane stanice se transformiraju u astrocite, a u olfaktornom bulbu, unutarnjem sloju granularnih stanica malog mozga i retikularnoj formaciji moždanog debla tvore stanice slične neuronima s pozitivnom reakcijom na neurofilamente. Nakon intravenske primjene hematopoetskih stanica odraslim miševima, GFP-obilježeni mikro- i astrociti otkriveni su u neokorteksu, talamusu, moždanom deblu i malom mozgu.

Osim toga, mezenhimalne matične stanice koštane srži, koje daju sve vrste stanica vezivnog tkiva, također mogu proći kroz neuronsku transdiferencijaciju pod određenim uvjetima (podsjetimo se da su embrionalni izvor mezenhima stanice neuralnog grebena). Pokazalo se da ljudske i mišje stromalne stanice koštane srži uzgajane in vitro u prisutnosti EGF-a ili BDNF-a eksprimiraju marker neuralnih progenitorskih stanica nestin, a dodavanje različitih kombinacija faktora rasta dovodi do stvaranja stanica s markerima glije (GFAP) i neurona (nuklearni protein, NeuN). Označene singenetske mezenhimalne matične stanice transplantirane u lateralnu klijetku mozga novorođenih miševa migriraju i lokaliziraju se u prednjem mozgu i malom mozgu bez narušavanja citoarhitekture mozga primatelja. Mezenhimalne matične stanice koštane srži diferenciraju se u zrele astrocite u striatumu i molekularnom sloju hipokampusa te naseljavaju olfaktorni žarulj, granularne slojeve malog mozga i retikularnu formaciju, gdje se transformiraju u neurone. Mezenhimalne matične stanice ljudske koštane srži sposobne su se in vitro diferencirati u makrogliju i integrirati u strukture mozga štakora nakon transplantacije. Izravna transplantacija mezenhimalnih matičnih stanica koštane srži u hipokampus odraslih štakora također je popraćena njihovom migracijom u moždani parenhim i neuroglijalnom diferencijacijom.

Pretpostavlja se da transplantacija matičnih stanica koštane srži može proširiti mogućnosti stanične terapije bolesti središnjeg živčanog sustava karakteriziranih prekomjernom patološkom smrću neurona. Međutim, treba napomenuti da ne prepoznaju svi istraživači činjenicu međusobne transformacije živčanih i hematopoetskih matičnih stanica, posebno in vivo, što je opet posljedica nedostatka pouzdanog markera za procjenu njihove transdiferencijacije i daljnjeg razvoja.

Transplantacija matičnih stanica otvara nove horizonte za staničnu gensku terapiju nasljedne neurološke patologije. Genetska modifikacija živčanih matičnih stanica uključuje umetanje genetskih regulatornih konstrukata, čiji produkti interagiraju s proteinima staničnog ciklusa u automatskom načinu regulacije. Transdukcija takvih gena u embrionalne progenitorske stanice koristi se za umnožavanje živčanih matičnih stanica. Većina genetski modificiranih staničnih klonova ponaša se poput stabilnih staničnih linija, ne pokazujući znakove transformacije in vivo ili in vitro, ali imaju izraženu sposobnost kontaktne inhibicije proliferacije. Prilikom transplantacije, umnožene transfektirane stanice integriraju se u tkivo primatelja bez narušavanja citoarhitekture i bez podvrgavanja tumorskoj transformaciji. Donorske živčane matične stanice ne deformiraju zonu integracije i ravnopravno se natječu za prostor s progenitorskim stanicama domaćina. Međutim, 2.-3. dana intenzitet diobe transfektantnih stanica naglo se smanjuje, što odgovara kontaktnoj inhibiciji njihove proliferacije in vitro. Embriji-primatelji transfektanata živčanih matičnih stanica nemaju abnormalnosti u razvoju središnjeg živčanog sustava, sva područja mozga u kontaktu s transplantatom razvijaju se normalno. Nakon transplantacije, klonovi živčanih matičnih stanica brzo migriraju iz zone injekcije i često prelaze odgovarajuće embrionalne zone duž rostralnog trakta, adekvatno se integrirajući s drugim područjima mozga. Integracija genetski modificiranih klonova i transficiranih staničnih linija živčanih matičnih stanica u mozak organizma domaćina karakteristična je ne samo za embrionalno razdoblje: ove stanice se implantiraju u brojna područja središnjeg živčanog sustava fetusa, novorođenčeta, odrasle osobe, pa čak i starijeg organizma primatelja te pokazuju sposobnost adekvatne integracije i diferencijacije. Posebno, nakon transplantacije u ventrikularnu šupljinu mozga, transficirane stanice migriraju bez oštećenja krvno-moždane barijere i postaju sastavne funkcionalne stanične komponente moždanog tkiva. Neuroni donora formiraju odgovarajuće sinapse i eksprimiraju specifične ionske kanale. Uz očuvan integritet krvno-moždane barijere, astroglija, derivat transfektiranih živčanih matičnih stanica, proširuje nastavke na moždane žile, a oligodendrociti izvedeni iz donora eksprimiraju mijelinski bazični protein i mijeliniziraju neuronske nastavke.

Osim toga, živčane matične stanice se transficiraju za upotrebu kao stanični vektori. Takvi vektorsko-genetski konstrukti osiguravaju in vivo stabilnu ekspresiju stranih gena uključenih u razvoj živčanog sustava ili se koriste za ispravljanje postojećih genetskih defekata, budući da su produkti tih gena sposobni kompenzirati različite biokemijske abnormalnosti središnjeg živčanog sustava. Visoka migracijska aktivnost transficiranih matičnih stanica i adekvatna implantacija u germinativne zone različitih područja mozga u razvoju omogućuju nam nadu u potpunu obnovu nasljednog nedostatka staničnih enzima. U modeliranju sindroma ataksije-telangiektazije (mutantne mišje linije pg i pcd), Purkinjeove stanice nestaju iz malog mozga pokusnih životinja tijekom prvih tjedana postnatalnog razvoja. Pokazalo se da unošenje živčanih matičnih stanica u mozak takvih životinja prati njihova diferencijacija u Purkinjeove stanice i granularne neurone. Kod pcd mutanata, poremećaji koordinacije pokreta su djelomično ispravljeni, a intenzitet tremora je smanjen. Slični rezultati dobiveni su transplantacijom kloniranih ljudskih živčanih matičnih stanica u primate kod kojih je degeneracija Purkinjeovih stanica inducirana pomoću onkonaze. Nakon transplantacije, donorske živčane matične stanice pronađene su u granularnim, molekularnim i Purkinjeovim staničnim slojevima parenhima malog mozga. Stoga, genetska modifikacija živčanih progenitorskih stanica može osigurati stabilnu i posvećenu modifikaciju fenotipa koja je otporna na vanjske utjecaje. To je posebno važno u patološkim procesima povezanim s razvojem čimbenika u primatelja koji sprječavaju preživljavanje i diferencijaciju donorskih stanica (npr. tijekom imunološke agresije).

Mukopolisaharidozu tipa VII kod ljudi karakterizira neurodegeneracija i progresivna intelektualna onesposobljenost, što se kod miševa modelira delecijskom mutacijom u genu beta-glukuronidaze. Nakon transplantacije transficiranih neuronskih matičnih stanica koje luče beta-glukuronidazu u moždane ventrikule novorođenih defektnih miševa primatelja, donorske stanice se prvo nalaze u terminalnoj zoni, a zatim se šire po cijelom moždanom parenhimu, stabilno ispravljajući integritet lizosoma u mozgu mutiranih miševa. U modelu Tay-Sachsove bolesti, retrovirusom transducirane neuronske matične stanice, kada se in utero primijene mišjim fetusima i transplantiraju u novorođene miševe, osiguravaju učinkovitu ekspresiju beta-podjedinice beta-heksosaminidaze kod primatelja s mutacijom koja dovodi do patološkog nakupljanja beta2-gangliozida.

Drugi smjer regenerativne medicine je stimulacija proliferativnog i diferencijacijskog potencijala vlastitih živčanih matičnih stanica pacijenta. Konkretno, živčane matične stanice luče NT-3 tijekom hemisekcije leđne moždine i asfiksije mozga u štakora, eksprimiraju NGF i BDNF u septumu i bazalnim ganglijima, tirozin hidroksilaze u striatumu, kao i reelin u malom mozgu i mijelinski bazični protein u mozgu.

Međutim, pitanjima stimulacije neurogeneze očito se ne posvećuje dovoljno pažnje. Nekoliko studija sugerira da se funkcionalno opterećenje živčanih centara odgovornih za razlikovanje mirisa odražava u stvaranju novih neurona. Kod transgeničnih miševa s deficitom neuronskih adhezijskih molekula, smanjenje intenziteta neurogeneze i smanjenje broja neurona koji migriraju u olfaktorne bulbuse bilo je kombinirano s oštećenjem sposobnosti razlikovanja mirisa, iako prag percepcije mirisa i kratkoročno olfaktorno pamćenje nisu bili narušeni. Funkcionalno stanje stanica dentatnog girusa igra važnu ulogu u regulaciji neurogeneze: slabljenje učinka glutamata na granularne stanice nakon uništenja entorhinalnog korteksa potiče proliferaciju i diferencijaciju neurona, a stimulacija vlakana perforantnog puta (glavnog aferentnog ulaza u hipokampus) uzrokuje inhibiciju neurogeneze. Antagonisti NMDA receptora aktiviraju procese stvaranja novih neurona, dok agonisti, naprotiv, smanjuju intenzitet neurogeneze, što po učinku podsjeća na djelovanje glukokortikosteroida. U literaturi se nalaze kontradiktorni rezultati istraživanja: informacije o eksperimentalno dokazanom inhibitornom učinku ekscitatornog neurotransmitera glutamata na neurogenezu nisu u skladu s podacima o stimulaciji proliferacije progenitorskih stanica i pojavi novih neurona s povećanjem napadajske aktivnosti u hipokampusu životinja s eksperimentalnim kainskim i pilokarpinskim modelima epilepsije. Istodobno, u tradicionalnom modelu epilepsije uzrokovane višestrukom subpragovnom stimulacijom određenog područja mozga (kindling) i karakterizirane manje izraženom smrću neurona, intenzitet neurogeneze povećava se tek u kasnoj fazi kindlinga, kada se u hipokampusu opaža oštećenje i smrt neurona. Pokazalo se da kod epilepsije napadajska aktivnost stimulira neurogenezu s abnormalnom lokalizacijom novih granularnih neurona, od kojih se mnogi pojavljuju ne samo u dentatnom girusu već i u hilusu. Takvi neuroni imaju veliku važnost u razvoju klijanja mahovitih vlakana, budući da njihovi aksoni tvore normalno odsutne obrnute kolaterale koji tvore brojne sinapse sa susjednim granularnim stanicama.

Upotreba regionalnih neuronskih matičnih stanica otvara nove perspektive za primjenu transplantacije stanica u liječenju metaboličkih i genetskih neurodegenerativnih bolesti, demijelinizirajućih bolesti i posttraumatskih poremećaja središnjeg živčanog sustava. Prije izvođenja zamjenske transplantacije stanica prema jednoj od metoda, provodi se odabir i širenje potrebne vrste neuronskih progenitorskih stanica ex vivo s ciljem njihovog naknadnog unošenja izravno u oštećeno područje mozga. Terapijski učinak u ovom slučaju posljedica je zamjene oštećenih stanica ili lokalnog oslobađanja faktora rasta i citokina. Ova metoda regenerativno-plastične terapije zahtijeva transplantaciju dovoljno velikog broja stanica s unaprijed određenim funkcionalnim karakteristikama.

Daljnja istraživanja molekularnih karakteristika i regenerativno-plastičnog potencijala zrelih moždanih matičnih stanica, kao i sposobnosti regionalnih matičnih stanica različitog tkivnog podrijetla za transdiferencijaciju, također bi trebala biti smatrana prikladnima. Danas je već proveden probir antigena hematopoetskih matičnih stanica koštane srži, s određivanjem kombinacije markera stanica sposobnih za transdiferencijaciju u neuralne matične progenitorske stanice (CD 133+, 5E12+, CD34-, CD45-, CD24). Dobivene su stanice koje in vitro tvore neurosfere i tvore neurone kada se transplantiraju u mozak novorođenih imunodeficijentnih miševa. Od interesa za staničnu ksenotransplantologiju su rezultati studija o mogućnosti unakrsne transplantacije matičnih stanica kod jedinki evolucijski udaljenih taksona. Rezultati implantacije neuralnih matičnih stanica u područje tumora mozga ostaju bez odgovarajuće interpretacije: transplantirane stanice aktivno migriraju kroz volumen tumora ne prelazeći njegove granice, a kada se stanice unesu u netaknuti dio mozga, opaža se njihova aktivna migracija prema tumoru. Pitanje biološkog značaja takve migracije ostaje otvoreno.

Treba napomenuti da je uspješna transplantacija neuralnih matičnih stanica, kao i drugih neuralnih progenitorskih stanica dobivenih iz ESC-a, moguća samo kada se koriste visoko pročišćene neuralne progenitorske stanice, budući da se nediferencirane embrionalne matične stanice neizbježno transformiraju u teratome i teratokarcinome kada se transplantiraju odraslom imunokompetentnom primatelju. Čak i minimalna količina slabo diferenciranih stanica u suspenziji donorskih stanica naglo povećava tumorigenost transplantata i neprihvatljivo povećava rizik od razvoja tumora ili stvaranja ne-neuralnog tkiva. Dobivanje homogenih populacija neuralnih progenitorskih stanica moguće je kada se kao alternativni izvor donorskog tkiva koriste stanice koje nastaju u određenim fazama normalne embriogeneze. Drugi pristup uključuje pažljivo uklanjanje neželjenih staničnih populacija selekcijom specifičnom za lozu. Upotreba ESC-a za neurotransplantaciju nakon njihove nedovoljne izloženosti in vitro faktorima rasta također je opasna. U ovom slučaju ne može se isključiti neuspjeh programa neuralne diferencijacije s formiranjem struktura svojstvenih neuralnoj cijevi.

Danas je sasvim očito da neuralne matične stanice pokazuju tropizam za patološki promijenjena područja središnjeg živčanog sustava i imaju izražen regenerativno-plastični učinak. Mikrookruženje na mjestu smrti stanica živčanog tkiva modelira smjer diferencijacije transplantiranih stanica, čime nadoknađuje nedostatak specifičnih neuralnih elemenata unutar zone oštećenja središnjeg živčanog sustava. U nekim neurodegenerativnim procesima nastaju neurogeni signali za rekapitulaciju neurogeneze, a neuralne matične stanice zrelog mozga sposobne su reagirati na ove poučne informacije. Brojni eksperimentalni podaci služe kao jasna ilustracija terapijskog potencijala neuralnih matičnih stanica. Intracisternalna primjena klona neuralnih matičnih stanica životinjama s ligacijom srednje moždane arterije (model ishemijskog moždanog udara) pomaže u smanjenju površine i volumena destruktivno promijenjenog područja mozga, posebno u slučaju transplantacije neuralnih matičnih stanica zajedno s FGF2. Imunocitokemijski se opaža migracija donorskih stanica u ishemičnu zonu s njihovom naknadnom integracijom s intaktnim stanicama mozga primatelja. Transplantacija nezrelih stanica mišje neuroepitelne linije MHP36 u mozak štakora s eksperimentalnim moždanim udarom poboljšava senzomotornu funkciju, a uvođenje tih stanica u moždane ventrikule pojačava kognitivnu funkciju. Transplantacija neuronski preformiranih hematopoetskih stanica ljudske koštane srži štakorima uklanja disfunkciju moždane kore uzrokovanu ishemijskim oštećenjem. U ovom slučaju, ksenogene neuronske progenitorske stanice migriraju s mjesta injekcije u zonu destruktivnih promjena u moždanom tkivu. Intrakranijalna transplantacija homolognih stanica koštane srži kod traumatskog oštećenja moždane kore u štakora dovodi do djelomične obnove motoričke funkcije. Donorske stanice se usađuju, proliferiraju, podvrgavaju se neuronskoj diferencijaciji u neurone i astrocite te migriraju prema leziji. Kada se ubrizgaju u striatum odraslih štakora s eksperimentalnim moždanim udarom, klonirane ljudske neuronske matične stanice zamjenjuju oštećene stanice središnjeg živčanog sustava i djelomično obnavljaju oštećenu funkciju mozga.

Ljudske živčane matične stanice uglavnom se izoliraju iz embrionalnog telencefalona, koji se razvija mnogo kasnije od kaudalno smještenih dijelova živčanog debla. Pokazana je mogućnost izolacije živčanih matičnih stanica iz leđne moždine ljudskog fetusa starog 43-137 dana, budući da u prisutnosti EGF-a i FGF2 te stanice tvore neurosfere i pokazuju multipotentnost u ranim pasažama, diferencirajući se u neurone i astrocite. Međutim, dugotrajni uzgoj živčanih progenitorskih stanica (više od 1 godine) lišava ih multipotentnosti - takve stanice sposobne su se diferencirati samo u astrocite, tj. postaju unipotentne. Regionalne živčane matične stanice mogu se dobiti kao rezultat parcijalne bulbektomije i, nakon reprodukcije u kulturi u prisutnosti LIF-a, transplantirati istom pacijentu s neurodegenerativnim promjenama u drugim dijelovima središnjeg živčanog sustava. U klinici je prvi put provedena nadomjesna stanična terapija korištenjem živčanih matičnih stanica za liječenje pacijenata s moždanim udarom praćenim oštećenjem bazalnih ganglija mozga. Kao rezultat transplantacije donorskih stanica, zabilježeno je poboljšanje kliničkog stanja većine pacijenata.

Neki autori smatraju da sposobnost neuronskih matičnih stanica da se usade, migriraju i integriraju u različita područja živčanog tkiva u slučaju oštećenja središnjeg živčanog sustava (CNS) otvara neograničene mogućnosti za staničnu terapiju ne samo lokalnih, već i opsežnih (moždani udar ili asfiksija), multifokalnih (multipla skleroza), pa čak i globalnih (većina nasljednih metaboličkih poremećaja ili neurodegenerativnih demencija) patoloških procesa. Doista, kada se klonirane mišje i ljudske neuronske matične stanice transplantiraju u životinje primatelje (miševe i primate) s degeneracijom dopaminergičnih neurona u mezostrijatalnom sustavu induciranom uvođenjem metil-fenil-tetrapiridina (model Parkinsonove bolesti) 8 mjeseci prije transplantacije, donorske neuronske matične stanice integriraju se u CNS primatelja. Mjesec dana kasnije, transplantirane stanice su lokalizirane bilateralno duž srednjeg mozga. Neki od rezultirajućih neurona donorskog podrijetla eksprimiraju tirozin hidrolazu u odsutnosti znakova imunološke reakcije na transplantaciju. Kod štakora kojima je primijenjen 6-hidroksidopamin (još jedan eksperimentalni model Parkinsonove bolesti), prilagodba transplantiranih stanica mikrookruženju u mozgu domaćina bila je određena uvjetima uzgoja živčanih matičnih stanica prije njihove transplantacije. Živčane matične stanice, koje se brzo razmnožavaju in vitro pod utjecajem EGF-a, učinkovitije su kompenzirale nedostatak dopaminergičnih neurona u oštećenom striatumu od stanica iz 28-dnevnih kultura. Autori smatraju da je to zbog gubitka sposobnosti percipiranja odgovarajućih signala diferencijacije tijekom procesa stanične diobe živčanih progenitorskih stanica in vitro.

U nekim studijama pokušalo se povećati učinkovitost utjecaja na procese reinervacije oštećenog striatuma presađivanjem embrionalnih stanica striatuma u ovo područje kao izvora neurotrofičnih čimbenika uz istovremeno presađivanje dopaminergičnih neurona ventralnog mezencefalona. Pokazalo se da učinkovitost neurotransplantacije uvelike ovisi o metodi uvođenja embrionalnog živčanog tkiva. Kao rezultat studija o transplantaciji preparata embrionalnog živčanog tkiva u ventrikularni sustav mozga (kako bi se izbjegla ozljeda parenhima striatuma), dobivene su informacije o njihovom pozitivnom učinku na motorički defekt kod parkinsonizma.

Međutim, u drugim studijama, eksperimentalna opažanja su pokazala da transplantacija preparata embrionalnog živčanog tkiva ventralnog mezencefalona koji sadrže dopaminergičke neurone u moždanu klijetku, kao i transplantacija GABA-ergičnih embrionalnih živčanih elemenata u striatum štakora s hemiparkinsonizmom, ne potiče obnovu oštećenih funkcija dopaminergičkog sustava. Naprotiv, imunocitokemijska analiza potvrdila je podatke o niskoj stopi preživljavanja dopaminergičnih neurona ventralnog mezencefalona transplantiranih u striatum štakora. Terapijski učinak intraventrikularne transplantacije embrionalnog živčanog tkiva ventralnog mezencefalona ostvaren je samo pod uvjetom istovremene implantacije preparata embrionalnih strijatalnih stanica u denervirani striatum. Autori smatraju da je mehanizam ovog učinka povezan s pozitivnim trofičkim učinkom GABA-ergičnih elemenata embrionalnog striatuma na specifičnu dopaminergičku aktivnost intraventrikularnih transplantata ventralnog mezencefalona. Izražena glialna reakcija u transplantatima bila je popraćena blagom regresijom parametara testa s apomorfinom. Potonje je, pak, koreliralo s udjelom GFAP-a u krvnom serumu, što je izravno ukazivalo na kršenje propusnosti krvno-moždane barijere. Na temelju tih podataka autori su zaključili da se razina GFAP-a u krvnom serumu može koristiti kao adekvatan kriterij za procjenu funkcionalnog stanja transplantata, a povećana propusnost krvno-moždane barijere za neurospecifične antigene poput GFAP-a patogenetska je veza u razvoju neuspjeha transplantata zbog autoimunog oštećenja živčanog tkiva primatelja.

S gledišta drugih istraživača, usađivanje i integracija živčanih matičnih stanica nakon transplantacije su stabilni i doživotni, budući da se donorske stanice nalaze u primateljima najmanje dvije godine nakon transplantacije i bez značajnog smanjenja njihovog broja. Pokušaji da se to objasni činjenicom da u nediferenciranom stanju živčane matične stanice ne eksprimiraju molekule MHC klase I i II na razini dovoljnoj da izazove imunološku reakciju odbacivanja mogu se smatrati istinitima samo u odnosu na nisko diferencirane živčane prekursore. Međutim, nisu sve živčane matične stanice u mozgu primatelja sačuvane u nezrelom stanju mirovanja. Većina njih prolazi kroz diferencijaciju, tijekom koje se molekule MHC u potpunosti eksprimiraju.

Posebno je nedovoljna učinkovitost korištenja intrastriatalne transplantacije embrionalnih ventralnih mezencefalonskih preparata koji sadrže dopaminergičke neurone za liječenje eksperimentalnog parkinsonizma povezana s niskom stopom preživljavanja transplantiranih dopaminergičnih neurona (samo 5-20%), što je uzrokovano reaktivnom gliozom koja prati lokalnu traumu moždanog parenhima tijekom transplantacije. Poznato je da lokalna trauma moždanog parenhima i istodobna glioza dovode do narušavanja integriteta krvno-moždane barijere s oslobađanjem antigena živčanog tkiva, posebno OCAR-a i neuron-specifičnog antigena, u perifernu krv. Prisutnost ovih antigena u krvi može uzrokovati proizvodnju specifičnih citotoksičnih antitijela na njih i razvoj autoimune agresije.

V. Tsymbalyuk i koautori (2001.) izvještavaju da tradicionalno gledište još uvijek vrijedi, prema kojem je središnji živčani sustav imunološki privilegirana zona izolirana od imunološkog sustava krvno-moždanom barijerom. U svom pregledu literature autori navode niz radova koji ukazuju na to da ovo gledište ne odgovara u potpunosti biti imunoloških procesa u mozgu sisavaca. Utvrđeno je da označene tvari unesene u moždani parenhim mogu doseći duboke cervikalne limfne čvorove, a nakon intracerebralne injekcije antigena u tijelu se stvaraju specifična antitijela. Stanice cervikalnih limfnih čvorova reagiraju na takve antigene proliferacijom, počevši od 5. dana nakon injekcije. Stvaranje specifičnih antitijela otkriveno je i tijekom transplantacije kože u moždani parenhim. Autori pregleda navode nekoliko hipotetskih puteva za transport antigena iz mozga u limfni sustav. Jedan od njih je prijelaz antigena iz perivaskularnih prostora u subarahnoidni prostor. Pretpostavlja se da su perivaskularni prostori lokalizirani duž velikih krvnih žila mozga ekvivalent limfnom sustavu u mozgu. Drugi put leži duž bijelih vlakana - kroz etmoidalnu kost u limfne žile nosne sluznice. Osim toga, postoji opsežna mreža limfnih žila u dura mater. Nepropusnost krvno-moždane barijere za limfocite također je prilično relativna. Dokazano je da su aktivirani limfociti sposobni proizvoditi enzime koji utječu na propusnost struktura moždanog "imunološkog filtera". Na razini postkapilarnih venula, aktivirani T-pomagači prodiru kroz netaknutu krvno-moždanu barijeru. Teza o odsutnosti stanica u mozgu koje predstavljaju antigene ne izdržava kritiku. Trenutno je uvjerljivo dokazana mogućnost predstavljanja antigena u CNS-u od strane najmanje tri vrste stanica. Prvo, to su dendritične stanice izvedene iz koštane srži koje su lokalizirane u mozgu duž velikih krvnih žila i u bijeloj tvari. Drugo, antigeni su sposobni prezentirati endotelne stanice krvnih žila mozga, a u suradnji s MHC antigenima, što podržava klonski rast T stanica specifičnih za te antigene. Treće, mikro- i astroglijske stanice djeluju kao agensi koji prezentiraju antigen. Sudjelujući u formiranju imunološkog odgovora u središnjem živčanom sustavu, astrociti stječu svojstva imunološke efektorske stanice i eksprimiraju niz antigena, citokina i imunomodulatora. Kada se inkubiraju s γ-interferonom (γ-INF), astroglijske stanice in vitro eksprimiraju MHC antigene klase I i II, a stimulirani astrociti sposobni su za prezentaciju antigena i održavanje klonske proliferacije limfocita.

Trauma moždanog tkiva, postoperativna upala, edem i fibrinski depoziti koji prate transplantaciju embrionalnog živčanog tkiva stvaraju uvjete za povećanu propusnost krvno-moždane barijere s oštećenom autotolerancijom, senzibilizacijom i aktivacijom CD3+CD4+ limfocita. Prezentaciju auto- i aloantigena provode astrociti i mikroglijalne stanice koje reagiraju na y-INF ekspresijom MHC molekula, ICAM-1, LFA-I, LFA-3, kostimulatornih molekula B7-1 (CD80) i B7-2 (CD86), kao i lučenjem IL-la, IL-ip i y-INF.

Posljedično, činjenica duljeg preživljavanja embrionalnog živčanog tkiva nakon intracerebralne transplantacije nego nakon njegove periferne primjene teško se može povezati s nedostatkom inicijacije transplantacijskog imuniteta. Štoviše, monociti, aktivirani limfociti (citotoksične CD3+CD8+ i T-pomoćne stanice) i citokini koje oni proizvode, kao i antitijela na antigene perifernog transplantata embrionalnog živčanog tkiva, igraju glavnu ulogu u procesu njegovog odbacivanja. Niska razina ekspresije MHC molekula u embrionalnom živčanom tkivu od određene je važnosti u stvaranju uvjeta za dulju otpornost neurotransplantata na imunološke procese T-stanica. Zbog toga se u eksperimentu imunološka upala nakon transplantacije embrionalnog živčanog tkiva u mozak razvija sporije nego nakon presađivanja kože. Ipak, potpuno uništenje pojedinačnih transplantata živčanog tkiva uočeno je nakon 6 mjeseci. U ovom slučaju, T-limfociti ograničeni antigenima MHC klase II pretežno su lokalizirani u zoni transplantacije (Nicholas i sur., 1988.). Eksperimentalno je utvrđeno da tijekom ksenološke neurotransplantacije, deplecija T-pomoćnih stanica (L3T4+), ali ne i citotoksičnih T-limfocita (Lyt-2), produžuje preživljavanje živčanog tkiva štakora u mozgu miševa primatelja. Odbacivanje neurotransplantata prati njegova infiltracija makrofagima i T-limfocitima domaćina. Posljedično, makrofagi domaćina i aktivirane mikroglijalne stanice djeluju in situ kao imunostimulirajuće stanice koje prezentiraju antigen, a povećana ekspresija antigena MHC klase I donora pojačava ubilačku aktivnost citotoksičnih T-limfocita primatelja.

Nema smisla analizirati brojne spekulativne pokušaje objašnjenja činjenice odbacivanja neurotransplantata reakcijom imunološkog sustava primatelja na endotelne stanice ili glialne elemente donora, budući da su čak i čiste linije neuronskih progenitorskih stanica podložne imunološkom napadu. Vrijedno je napomenuti da ekspresija Fas liganada od strane moždanih stanica koje vežu receptore apoptoze (Fas molekule) na T limfocitima koji infiltriraju mozak i induciraju njihovu apoptozu igra važnu ulogu u mehanizmima duljeg preživljavanja transplantata unutar CNS-a, što je tipičan zaštitni mehanizam transbarijernih autoimunogenih tkiva.

Kao što V. Tsymbalyuk i koautori (2001.) s pravom primjećuju, transplantacija embrionalnog živčanog tkiva karakterizirana je razvojem upale uz sudjelovanje stanica senzibiliziranih na moždane antigene i aktivirane stanice, antitijela, a također i kao rezultat lokalne proizvodnje citokina. Važnu ulogu u tome igra već postojeća senzibilizacija tijela na moždane antigene, koja se javlja tijekom razvoja bolesti središnjeg živčanog sustava i može biti usmjerena na antigene transplantata. Zato se stvarno dugoročno preživljavanje histinoinkompatibilnih neurotransplantata postiže samo supresijom imunološkog sustava ciklosporinom A ili uvođenjem monoklonskih antitijela u CD4+ limfocite primatelja.

Stoga mnogi problemi neurotransplantacije ostaju neriješeni, uključujući i one vezane uz imunološku kompatibilnost tkiva, što se može riješiti tek nakon ciljanih temeljnih i kliničkih istraživanja.